МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ
СУМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
АГРОНОМІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра захисту рослин
Завідувач кафедрою_____________________
А.К.Мішньов
ДИПЛОМНА РОБОТА
на тему: «Біохімія трансгенної картоплі в умовах
України»
Для одержання кваліфікації спеціаліста
за спеціальністю 7.130105 – Захист рослин»
Виконавець _________________ (Загорулько О.)
Науковий керівник ______________ (Чіванов В.Д.)
Консультант з екологічної експертизи ________________ (Жатова Г.О.)
Консультант з питань
техніки безпеки _________________ (Шандиба О.Б.)
Суми - 2001
ЗМІСТ
Стор.
Вступ.................................................................
.................................................
1. Огляд літератури…………………………………………………………….
1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей глікоалкалоїдів рослин родини
Solanaceae................................………………………………
1. Глікоалкалоїди рослин картоплі та їх будова………………………….
2. Глікоалкалоїди як токсичні сполуки……………………………………
3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних, грибкових захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів картоплі……………………………………………………………………
2. Природні умови господарства........................................................
..............
3. Методика проведення досліджень........................................................
......
3. Результати досліджень........................................................
.........................
4. Охорона праці.............................................................
..................................
5. Охорона навколишнього середовища.......................................................
Висновки............................................................
..............................................
Список використаної літератури..........................................................
.....
ВСТУП
Підвищений “тиск” на організм людини ксенобіотичних сполук природного
та штучного походження обумовлює необхідність поглибленого вивчення таких
сполук, і в першу тих із них, котрі входять до складу найбільш поширених
харчових продуктів, зокрема картоплі. Глікоалкалоїди картоплі являють собою
групу вторинних метаболітів, яким притаманні найрізномантніші види
біологічної активності [ ]. Так, дослідами in vitro доведена здатність
цих сполук спричинювати хромосомні аберації, порушувати цілісність ліпосом
та природніх біомембран тощо [ ]. Останнє свідчить на користь того, що
глікоалкалоїдам притаманна потенційна мутагенна і, можливо, канцерогенна
активність [ ]. Виходячи з наведеного, цілком природньою є підвищена
зацікавленість в дослідженні глікоалкалоїдів з боку фахівців в галузях
медичної токсикології і генетики людини, тим більше, що в останні роки на
світовий ринок виходять нові сорти продовольчої картоплі, отриманої як
шляхом “класичної” селекції за участі дикоростучих видів роду Solanum [
], так і за допомогою генетичної інженерії (New Leaf(, Monsanto, США).
Обидва підходи не виключають біосинтезу в тканинах рослин картоплі, зокрема
бульбах, окрім характерних для культурної картоплі глікоалкалоїдів (-
Соланіну та (-Чаконіну “мінорних” глікоалкалоїдів (солакаулін, соласолін,
соламаргін, деміссін, томатін, лептін І і ІІ, лептінін-І і ІІ тощо), які
ведуть походження з дикоростучих попередників, або синтезуються de novo [
]. Останнім притаманні токсикологічні характеристики, відмінні від добре
відомих аналогічних показників (-Соланіну та (-Чаконіну. Якщо прийняти до
уваги встановлений факт щодо синергетичного багаторазового підсилення
біологічної активності суміші двох різних за хімічною структурою
глікоалкалоїдів [ ], то стає цілком обгрунтованою необхідність
досліджень кількісних та якісних показників глікоалкалоїдів продовольчої
картоплі паралельно з селекцією та молекулярною інженерією, успішність яких
залежить від наявності нових високочутливих методів фізико-хімічного
аналізу. Складність аналізу сумарної фракції глікоалкалоїдів з рослин
картоплі пов’язана, зокрема з тим, що субфракція “мінорних” глікоалкалоїдів
не перевищує за масою 0,5-5% [ ].
Останнім часом в аналізі біомолекул набули широкого розповсюдження
методи м’якоіонізаційної мас-спектрометрії, зокрема плазмено-десорбційна
мас-спектрометрія (PDMS). Зважаючи на це, нами зроблена спроба
проаналізувати фракцію глікоалкалоїдів бульб та квітів картоплі трансгенних
сортів NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic за допомогою PDMS мас-
спектрометрії. Таким чином, метою наших досліджень був докладний аналіз
глікоалкалоїдів бульб та квітів картоплі трансгенних сортів NewLeaf 6
Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic новітнім мас-спектрометричним методам.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1. Загальна характеристика фізико-хімічних властивостей глікоалкалоїдів рослин родини Solanaceaе
Рослини картоплi культурних та диких видів мiстять серед численних
органiчних сполук групи вторинних метаболітів глiкоалкалоїди [ ],
найважливiшими з яких є a-соланiн, a-чаконiн, деміссин, лептіни I,II,III,
соламарін, коммерсонін [ ]. Фiзiологiчнi функцii глiкоалкалоїдiв
пов'язанi з явищем стiйкостi рослин картоплі проти фiтопатогенiв i
шкiдникiв [ ]. Крiм того, глiкоалкалоїди беруть безпосередню участь в
бiохiмiчних процесах, які притаманні тканинам листкiв, пагонiв, квiток,
бульб рослин картоплi (цвiтiння, видова сумiснiсть, утворення насiння);
обумовлюють разом з iншими вторинними метаболiтами смаковi якостi та
придатнiсть картоплi для переробки [ ], а також мають певне значення як
токсичні, ембріотропні і канцерогеннi сполуки природнього походження [
]. Зважаючи на це, багато перспективних за врожайнiстю та iншими
господарсько-корисними якостями сортiв картоплi не були рекомендованi для
широкого використання саме завдяки пiдвищеному вмiсту глiкоалкалоїдiв [
]. На думку вiтчизняних та зарубiжних [ ] дослiдникiв, кiлькiснi та якiснi
характеристики глiкоалкалоїдiв нових сортiв i гiбридiв картоплi
заслуговують на поглиблене вивчення. Одним з найважливіших питань,
пов’язаних з біохімією та фізіологією глікоалкалоїдів, яке і досі не
знайшло однозначного вирішення, є встановлення корелятивних зв’язків між
параметрами метаболізму глікоалкалоїдів та ступенем стійкості сортів
картоплі проти шкідників і фітопатогенів [ ]. Іншим дискусійним
питанням є невизначеність зв’язків між кількісним накопиченням
глікоалкалоїдів в тканинах рослин картоплі різних сортів, зокрема бульбах і
умовами вирощування (погодно-кліматичні умови протягом конкретного
вегетаційного сезону, тип грунтів, удобрення тощо), а також умовами
зберігання (температура, освітленість, вологість тощо)[ ]. На думку
провідних вчених дискусійні та суперечливі результати в цьому напрямку
дослідження отримані тому, що, по-перше, на інтенсивність біосинтезу
вторинних метаболітів взагалі і глікоалкалоїдів зокрема, різноспрямовано
впливає велика кількість факторів зовнішнього середовища і це, разом з
підвищеною лабільністю та чутливістю ферментних систем метаболізму
глікоалкалоїдів до зазначених факторів обумовлює суттєві розбіжності, про
які згадувалось вище; і, по-друге, більшість ранніх робіт були проведені
без урахування різноманітності глікоалкалоїдів за хімічною структурою – в
межах цих досліджень визначали тільки їх сумарну кількість ваговим або
колориметричним методами [ ].
Проте, глікоалкалоїди картоплі являють собою досить велику групу
сполук, до складу якої входять «мажорні» (a-соланiн та a-чаконiн у
культурних видів картоплі) і численні «мінорні» (b-соламарін, деміссидін,
5b-соланідан-3a-ол, томатіденол) компоненти. Крім того, тканини рослин
картоплі містять спеціалізовані ферментні системи, які модифікують інтактні
молекули глікоалкалоїдів з утворенням численних проміжних сполук,
фізіологічна роль яких вичерпно не з’ясована (b-соланін, b-чаконін, g-
соланін, g-чаконін тощо)[ ]. Таким чином, дослідження статичних і
динамічних кількісних та якісних параметрів глікоалкалоїдів рослин картоплі
різних сортів в процесах вирощування в умовах конкретних кліматичних зон,
зберігання та переробки, а також під впливом фітопатогенів, мають певні
перспективи за умов використання з метою аналізу цих сполук нових
високоінформативних фізико-хімічних методів досліджень [ ]. В
Сумському ДАУ та Інституті прикладної фізики НАНУ (м.Суми) в 1994-2000 рр.
в межах проекту «М’якоіонізаційна мас-спектрометрія в агробіології» провели
цикл досліджень глiкоалкалоїдів рослин картоплi за допомогою новiтнього
фiзико-хiмiчного методу аналізу полярних, термолабільних, нелетючих
органiчних сполук – плазмено-десорбційної часопрольотної плазмено-
десорбцiйної мас-спектрометрiї з iонiзацiєю уламками подiлу 252Cf (МС-
ПДМС)[ ].
Алкалоїди являють собой велику групу рослинних речовин різного хімічного складу, яким притаманна специфічна дія на організм ссавців та людини. Алкалоїди є азотовміськими гетероциклічними сполуками, що містять в своєму складі атом азоту. Загальною властивостю даної групи речовин є їх надзвичайно сильна фізиологічна дія на організм тварин та людей. Більшість алкалоїдів діють на нервову систему: в невеликих дозах здійснюють збуджуючий вплив, в великих - пригнічують, а в ще більших є сильнодіючими отрутами [ ]. Фізіологічне значення алкалоїдів в життєдіяльності самих рослин досі не з`ясовано. До цього часу не вдалося ще з великою достовірностю показати місце алкалоїдів в життєво важливих процесах обміну речовин, з іншого боку немає неспростовних доказів того, що алкалоїдоносні види рослин можуть існувати без алкалоїдів [ ].
В ряді робіт відзначається вплив алкалоїдів на обмін речовин у рослин,
виникнення квітів, формування органел та органів рослин, ріст клітин, поділ
ядер і т.д. Було доведено, що алкалоїди в клітинах рослин якимось чином
ізольовані від внутрішнього середовища клітини. Так, розчини нікотину,
нанесені на рослинні тканини табаку, чинять всебічну негативну
фітотоксичну дію навіть при концентрації, рівній їх концентрації в
тканинах. Доведено, що високий вміст алкалоїдів часто пов`язаний зі
зниженням сили росту рослин. Інакше кажучи, у рослин в період вегетації та
спокою існує тісний взаємозв`язок: «білковий азот - алкалоїди». Цими
причинами, на думку Горяєва, пояснюється зміна складу алкалоїдів, а в
деяких випадках і їх повна відсутність в тканинах алкалоїдних рослин
(Solsola richteri. Girgensonia Oppositiflora. Anabasis turkestanika) [
].
1.1. 1. Глікоалкалоїди рослин картоплі та їх будова.
Глікоалкалоїди, які містяться в бульбах картоплі, раніше називали
загальним терміном «соланін». В наш час встановлено, що так званий
«соланін» являє собою суміш якнайменше 6 різних глікозідних сполук: ?-, ?-
, ?-соланіна та ?-, ?-, ?-чаконіна. Ці сполуки мають один і той же аглікон
(«корове ядро») – соланідин і відрізняються між собою складом глікозидного
ланцюжка (Рис.1). Трисахаріди - ?-соланін і ?-чаконін є основними формами і
складають в тканинах картоплі біля 95% усієї суми глікоалкалоїдів групи
соланіна [ ]. Крім ?-, ?-, ?-соланіна та ?-, ?-, ?-чаконіна, відомі
інші глікоалкалоїди пасльонових: солакаулін, соласолін, соламаргін,
демісін, томатін, лептін, лептінін-1, лептінін-2 та інші. Всі
гликоалкалоїди складаються з двох основних складових, виникаючих при
кислотному гідролізі цих речовин – аглікона, який і є власне «алкалоїдом»,
і декількох моносахарів, які знаходяться в молекулі глікоалкалоїда в
вигляді глікозідного ланцюга, зв`язаного з агліконом [ ].
Глікоалкалоїди культурної та дікої картоплі (Solanum) можна систематизувати
в окремі групи. До групи соланідіна відносяться: ?-, ?-, ?-соланін та ?-, ?-
, ?-чаконін, солакаулін і глікоалкалоїд, виділений з групи Akaulia. Іншу
групу алкалоїдів складають сполуки, агліконом яких є соласодін. Сюди
входять соласонін і соламаргін. Соласонін і соламаргін є основними
алкалоїдами Solanum nigrum, Solanum laciniatum більшості інших видів
Solanum
[ ].
Соласодамін знайдений в листках Solanum auriculatum і Solanum magrinatum. В групу, яка містить в якості аглікона демісідін, входить демісин, знайдений у Solanum demissum і глікоалкалоїд, виділений із Solanum polyadenium. Лептіни – глікоалкалоїди,
Рис.1. Хімічна структура агліконів, знайдених в рослинах картоплі [
].
знайдені Куном і Левом, виявлені у Solanum chacoense. Групи Eutuberosa,
Andigena, і Commersonia містять тільки - соланін, ці види містять також
чаконін. Ці два глікоалкалоїди зустрічаються завжди разом, що доведено
хроматографічними дослідженнями. Демісин присутній в рослинах групи Demissa
і Acaulia, за виключенням Solanum acaulia, в складі якого знайдено
солакаулін. Демісин знайдений також у Solanum jamesii. У форм, які не дають
бульб, крім (-соланіна, який і тут частіше всього зустрічається, найбільшу
групу складають форми, які містять томатін. І тільки єдина форма Solanum
poliadenium, яка створює бульби, містить томатін. Інші алкалоїди
зустрічаються тільки в деяких форм, нприклад, соласодамін – у Solanum
sodomaneum i Slanum aviculare.
Всі алкалоїди картоплі належать до стероїдної групи похідних
циклопентанопергідрофенантрена і складаються з алкалоїда (аглікона) та
цукру, зв’язаного з ним глікозідним зв’язком. Аглікон має стероїдну будову,
містить атоми азоту, який утворює третинну або вторинну аміногрупу.
Прикладом першого типу являється соланідін, другого-томатідін і соласодін.
Глікозідна частина являє собою моно-, ді-, три-, і тетрасахаріди; до їх
складу може входити глюкоза (Glu), галактоза (Gal), рамноза (Rha) і ксілоза
(Xyl). Наприклад, (-соланін складається з аглікона-соланідіна і
трисахаріда, який при гідролізі кислотою розпадається на галактозу, глюкозу
і рамнозу. Соланін має розгалужений сахарний ланцюжок: безпосередньо з
агліконом зв`язана галактоза, а глюкоза і рамноза складають бокові ланцюги.
Подібну будову мають глікозідні частини глікоалкалоїдів демісіну, томатіну,
(-чаконіну, соласодіну і соламаргіну [ ].
Під впливом гідролізу глікоалкалоїди розпадаються на цукор і аглікон, фізичні і хімічні властивості якого і вказують на велику схожість його зі стероїдами. Стероїди утворюють різноманітну групу важливих природних речовин. Сюди відносяться стеріни, жовчні кислоти, гормони розмноження, вітаміни групи Д, глікозиди, різні алкалоїди і інші речовини. Базовою структурою усіх стероїдів є стеран (циклопентанопергідрофенантрен).
До класу стероїдів належать також фітостерини: сіто-, стігма-, і кампестерін, холестерін, ергостерін, жовчні кислоти.
Сполуки стероїдів з сахаром належать до групи глікозідів. В цю групу, крім глікоалкалоідів, входять «сердечні глікозіди», які містяться в деяких рослинах із родини Strophanthus і Digitalis. Стероїдні саконіни також являють собою глікозіди агліконів, котрі э похідними циклопентанопергідрофенантрена. Сапоніни не містять в своєму складі атом азоту [ ].
Одним з доказів схожості аглікона глікоалкалоідів зі стероїдами є те, що їх можливо перетворити в метилциклофенантрен. Ця сполука синтезується тим же шляхом із стероїдів. При третьому атомі вуглецю аглікона знаходиться група, яка може сполучатися глікозідно з моносахаридами. Остаточно стероїдну будову аглікона вдалося довести, коли похідне аглікона отримали з відомих стероїдів і, навпаки, похідні стероїдів- із аглікона глікоалкалоїдів; наприклад, із безазотної речовини криптогеніна - соласодін, із соласодіна - стероїдний сапогенін - діосгенін. Веліка схожість з сапонінами виявляється і в будові сахарної частини глікоалкалоідів. Загальною властивістю сапонинів і глікоалкалоідів являється їх гемолітична дія [ ].
Таким чином, основними глікоалкалоїдами культурної картоплі є (- соланін та (-чаконін. Всі глікоалкалоїди різних видів картоплі складаються з двох основних частин: аглікона (алкалоїда), який має стероїдну будову, і молекули сахару, в склад якої входять моно-, ді-, три-, або тетрасахариди.
1.1.2. Глікоалкалоїди як токсичні сполуки
Глікоалкалоїди соланін та чаконін в невеликій кількості розглядається
як цілком можливі компоненти бульб картоплі, при надмірній кількості вони
погіршують смакові якості картоплі. У бульб з`являється гіркуватий смак,
при вживанні таких бульб в харчування віникають чуття зуду в горлянці [ ].
Встановлена визначена кореляція між наявністю глікоалкалоїдів і
органолептичними смаковими якостями вареної картоплі. При дуже низькому
вмісті глікоалкалоїдів в бульбах (порядку 1-5 мг%) смак вареної картоплі
трохи гірший, ніж при середньому (5-10 мг%). Але збільшення їх вмісту вище
за 26 мг% на сиру речовину дуже погіршує смак вареної картоплі і стає
небезпечним для здоров`я людини [ ].
Бульби картоплі, які містять ніж 20 мг% глікоалкалоїдів, не рекомендується вживати в харчування, осбливо коли картопля вареться зі шкірочкою. Почищені бульби менш небезпечні, так як значна частина глікоалкалоїдів видаляється зі шкірочкою, а частина переходить в воду, при варинні ж неочищених бульб цього не відбувається вз`язку з слабкою проникністю шкірочки. За даними М.Г.Шевченко [ ], нйбільшу небезпеку для здоров`я становить нерозчинний в воді соланін, зосереджений в основі пророслх вічок.
3. Роль глікоалкалоїдів в явищі імунітета до бактеріальних, грибкових захворювань і шкідників та їх значення в селекції нових сортів картоплі.
Глікоалкалоїди привертають увагу селекціонерів-картоплярів в зв`язку з їх токсичною дією на бактеріальні та грибкові захворювання картоплі, а також в зв`язку з токсичною дією на колорадського жука [ ].
Встановлено, що соланін затримує ріст бактерій, а 0,1-0,5% -ний розчин його викликає відмирання протоплазми. Виділені фунгіцидні якості глікоалкалоїдів в відношенні ряду патогенних грибів, таких як Microsporum audoine, Trichophyton gypseum, Fusarium oxуsporum, зооспор Phytophthora infestans, Helminthosporum carbonum.
В Інституті біохімії РАН досліджували фунгіцидні властивості
глікоалкалоїдів і інших сполук картоплі, наділених антибіотичними якостями,
а також вивчали дію механічних пошкоджень і зараження Phytophtora infestans
на утворення і розподіл глікоалкалоїдів в тканинах бульб [ ].
Виявилось, що глікоалкалоїдам (-соланіну та (-чаконіну притаманна більша
фунгіцидна активність ніж фенолам (кофейній і хлорогеновій кислотам). Так,
в концентрації 0,1 мг/мл останні не впливали на кінетичні показники росту
фітофтори, тоді як глікоалкалоїди пригнічували його майже на 70%. Зооспори
цього паразита гинули вже при концентрації (-соланіна 5 мкг/мл.
Соланин, чаконін і соланідін інгібують радіальний рост Alternaria
solani на картоплі. По ступеню інгібування на першому місці стоїть
соладінін, потім чаконін і соланін. При концентрації 500 мг/л соланін
викликає 50% інгібування росту після 96-годинного періоду інкубації при
24оС. Встановлено наявність збільшення чутливості листків до розвітку
пошкодження яке супроводжується зменшенням концентрації глікоалкалоїдів в
листках в міру їх старіння. Наприклад, 30-денні листки сорту Катадин
містять 950 мг/кг глікоалкалоїдів і стійкі до паразиту, тоді як старіючі 90-
денні листки містять тільки 150мг/кг глікоалкалоїдів і значно уражаються
грибом [ ].
Проте подальші дослідження показали, що хоча глікоалкалоїди і наділені
фунгітоксичністю, вони все ж таки не є вирішальним фактором в явищі
фітоімунітета картоплі [ ]. Взагалі після інфікування в бульбах картоплі
накопичується хлогенова та кофейна кислоти, скополетин, (-соланін, (-
чаконін, рішитин, фітуберин. Всі зазначені сполуки, за виключенням рішитіна
та фітуберіна, присутні в шкірочці бульби в кількостях рівних або більших,
аніж синтезованих за умов інфікування патогеном очищеної картоплі.
Хлорогенова та кофейна кислоти знайдені в усіх частинах рослини. Вони
продукуються в бульбах картоплі в результаті пошкоджень та інфекції
багатьма патогенними та не патогенними організмами і накопичуються (або
присутні) в деяких здорових тканинах рослини картоплі в кількостях, які
можуть пригнічувати мікроорганізми. Механічне пошкодження чи інфекція
викликає швидке окислення цих речовин, а продукти окислення токсичні для
багатьох мікроорганізмів. На ранніх стадіях інфекції після інокуляції бульб
деякими расами фітофтори накопичуються поліфеноли. В тканинах,
інокульованих несумісними расами фітофтори, або в зрізах накопичується
тільки хлорогенова кислота.
Глікоалкалоїди (-соланін і (-чаконін зосереджуються біля пошкоджених ділянок бульби [ ]. Про те, що глікоалкалоїди не є вирішальним фактором в імунітеті картоплі, свідчать результати дослідів, проведених на раневій перидермі бульб. В зараженій фітофторою раневій тканині картоплі глікоалкалоїди не накопичуються. Звідси виходить припущення, що фітофтора наділена здатністю руйнувати глікоалкалоїди.
В раневій тканині, зараженій несумісною расою фітофтори, не
відбувається накопичення глікоалкалоїдів, не виявляються фітоaлексини
рішитин і любімін. В непошкодженій паренхимі бульб не синтезуються ні
глікоалкалоїди, ані фітоалексіни. В раневій перидермі весь мевалонат
використовується на синтез глікоалкалоїдів. В відмерлій тканині, навпаки.
Утворення глікоалкалоїдів майже не відбувається, а мевалонат
використовується для синтезу рішитіна та любіміна. В зараженій тканині, як
і в раневій, глікоалкалоїди хоча і утворюються, але розкладаються
фітофторою [ ].
В США проводили роботи по виведенню сортів картоплі, наділених
полігенною стікістю до фітофтори, при цьому стикалися з труднощами,
обумовленими отриманням гібридів з високим вмістом в бульбах
глікоалкалоїдів. Дослідження, проведені в селекційному центрі штата Західна
Віргінія, на 15 клонах картоплі, наділених різною ступеню полігенної
стійкості до фітофтори і трьох стандартних сортах, не підтвердили наявність
взаємозв`язку між зазначеною стійкістю і вмістом в бульбах глікоалкалоїдів.
В результаті прийшли до висновку, що можливе створення нових сортів
картоплі з полігенною стійкістю до фітофтори і звичайним, або зниженим
вмістом глікоалкалоїдів в бульбах. Встановлена висока ступінь кореляції
(r=0,82) між вмістом глікоалкалоїдів в листках та бульбах випробуваного
селекційного матеріалу [ ].
Дослідженнями Куна було встановлено, що непоїдання листків дикого виду картоплі Solanum demissum колорадським жуком обумовлена наявністю в них глікоалкалоїда демісіна [ ]. Це спонукало вітчизняних ботаніків організувати експедицію в країни Південної Америки для пошуків диких видів картоплі, стійких до колорадського жука. Під час експедиції було знайдено біля 10 таких видів, частина з них використовується в селекції при виведенні нових сортів картоплі.
Глікоалкалоїди бульбоносних видів дикої картоплі належать головним
чином до групи соланіну чи демісину. Найбільша кількість стійких до
колорадського жука видів картоплі – S.commersonii, S.chacoense,
S.gibberulosum, S.shikii, S.dolichostigma відноситься до Commersonia, але
демісин в них відсутній. Високостійкими до колорадського жука виявились
також S.polyadenum, S.jamesii, котрі містять малу кількість демісину. Дикі
види картоплі, які характеризуються низьким вмістом демісину, за
виключенням видів Acaulia, виявились надто стійкими до колорадського жука [
].
2. ПРИРОДНІ УМОВИ ГОСПОДАРСТВА
Виробнича практика була проведена в учбово-навчальному комплексі
(УНВК) Сумського державного аграрного університету (СДАУ) який знаходится в
м. Суми (південна частина). УНВК розташований у північній частині
Лівобережного Українського Лісостепу, яка в цілому характеризується
помірним кліматом. Літо – тепле, із значною кількістю опадів. Зима – не
дуже холодна, з відлигами.
Згідно багаторічних даних Сумської метеостанції, середньорічна температура району, де розташований УНВК, дорівнює 60 С (табл. 1). Найбільш холодними місяцями є січень і лютий, найбільш теплими – липень, при чому абсолютний мінімум температур повітря -360 С спостерігається в січні, а максимум +380 С - у серпні. Останні весняні заморозки у повітрі спостерігаються у ІІІ декаді квітня, в окремі роки – на початку травня, а перші осінні заморозки – на початку жовтня, з
1. Середня багаторічна температура повітря за місяцями
|Місяці |І |ІІ |ІІІ|IV |V |VI |VII|VII|ІХ |Х |ХІ |ХІІ|Середньо|
| | | | | | | | |I | | | | |- |
| | | | | | | | | | | | | |річна |
|Середньо-мі|-7,|-7,|-2,|6,3|14,|17,|19,|18,|13,|6,6|-0,|-5,|6,0 |
|сячна |8 |6 |6 | |6 |4 |6 |3 |0 | |1 |5 | |
|температура| | | | | | | | | | | | | |
|повітря | | | | | | | | | | | | | |
коливаннями 11.09. – 27.10. Довжина безморозного періоду складає приблизно
155 днів. Зима сніжна, характеризується нестійкою погодою, поряд із
низькими температурами -250 - -300 спостерігаються відлиги з температурами
+40 - +50.
Часті відлиги взимку при глибокому промерзанні грунту іноді призводить до застою талих вод і утворенню льодяної кірки, що негативно впливає на перезимівлю озимих. Висота снігового покрову досягає 22 см. Розподілення його на більшій частині території нерівномірне: сніг накопичується у балках, ложбинах стоку.
Максимальна глибина промерзання грунту на рівних ділянках сягає 135 см, мінімально – 40 см, середня – 88 см.
Середньорічна кількість опадів становить 510 мм (табл. 2).
2. Середня багаторічна кількість опадів за місяцями
|Місяці |І |ІІ |ІІІ|IV |V |VI |VII|VII|ІХ |Х |ХІ |ХІІ|За рік |
| | | | | | | | |I | | | | | |
|Опади в мм |28 |23 |26 |40 |43 |67 |68 |53 |45 |42 |33 |37 |510 |
З таблиці видно, що найбільша кількість опадів випадає у літньо- весняний період, що співпадає з максимальним ростом сільськогосподарських культур і сівбою озимих і сприяє їх розвитку.
Взимку переважають північно-східний та північно-західний вітри.
Напрямок їх часто змінюється, що призводить до різних змін температури. За
останні роки спостерігаються суховійні південно-східні вітри, які сильно
висушують грунт і знижують врожай основних сільськогосподарських культур.
Рельєф УНВК рівнинний, але західна частина дещо полога і засівається багаторічними травами.
Грунти, які представлені на дослідному полі, -це типові чорноземи,
важкосуглинисті, середньогумусні на льосовидному суглинку. Грунт
характеризується високим вмістом крупнопилови часток (0,01-0,05 мм), частка
яких сягає 55% і більше. Вміст часток, які належать до фракції розміром
0,001 мм і менше сягає 25-30%, що обумовлює високу ємність поглинання, яка
досягає 28-30 мг/екв на 100 г грунту. Реакція грунту практично нейтральна.
Значення рН коливається в межах 6,5-7,5/6,5-7,6 у верхніх горизонтах і 7,3-
7,5 у нижніх (карбонатних).
Розорювана частина грунту приблизно до 30 см., яка містить у собі необхідні елементи живлення (N, P, K) : азоту нітратного 2,2-3,; азота амонійного 11,2-10,6; фосфора 157, калія 70 мг на 100 г грунту, відсоток гумусу 4,0%.
УНВК заснований в 1987 р. для проведення науково-дослідної роботи та для демонстрації різних технологій вирощування сільськогосподарських культур. До складу УНВК входять комплекс по оздоровленню насінневої картоплі методами меристеми, обласне об’єднання “Сортнасіняовоч” і науково- дослідне об’єднання “Еліта” з лабораторією картоплі і дослідним господарством. До складу господарства також входять дослідні поля в с.Постольне, Гамаліївка та Косівщина, де вирощуються озима пшениця, овес, гречка, картопля, ячмінь, овес, гречка, горох, багаторічні трави, капуста, морква, столові буряки, цибуля. Урожайність деяких культур в 2000 році: озима пшениця 35 ц/га; овес 41 ц/га; гречка 20 ц/га; картопля 150 ц/га; соняшник 15 ц/га; яра пшениця 13 ц/га; горох 13 ц/га; буряки цукрові 460 ц/га; кукурудза на зерно – 42 ц/га.
Дослідні поля УНВК займають 43 га сільськогосподарських угідь.
Сівозміна займає майже всі 43 га. Схема сівозміни така:
1. Овес 10 га.
1. Озима пшениця 5 га.
2. Картопля (насіння )0,7.
3. Ячмінь .
4. Гречка 4,6 га.
5. Цукровий буряк 10 га.
Із сівозміни виділена ділянка 2,5 га, розміщена на схилі, яка засівається багаторічними травами для тварин віварія.
Крім того в межах УНВК вирощували в 2000 р.такі культури:
1. Багаторічні трави 2,4 га
2. Молодий сад 3 га
3. Томати 0,2 га
4. Цибуля 0,25 га
5. Буряки столові 0,07 га
6. Морква 0,07 га
7. Кріп 0,01 га
8. Петрушка 0,01 га
9. Капуста 0,75 га
10. Огірки 0,05 га.
На дослідних ділянках проводять експериментальні роботи кафедри селекції (0,7 га) і рослинництва (0,3 га).
Для роботи на дослідних полях УНВК закріплений підрозділ і повний
комплекс тракторів та сільськогосподарського обладнання. Для проведення
дослідів виділено ділянки площею в 0,1 га. В склад підрозділу входять:
завідуючий дослідним полем і два інженери. Для зберігання і ремонту техніки
за дослідним полем закріплений спеціальний бокс, а для зберігання зернової
продукції - ангар. Техніка УНВК представлена тракторами Т-150, Т-70, Т-
150К, МТЗ-82, Т-25, Т-16.
3. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ
В експериментi використовувались бульби та квітки картоплi сортів
NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic (зразки люб’язно надані
проф.А.А.Підгаєцьким, Інститут картоплярства УААН, смт.Немішаєве, Київська
обл.). Зразки бульб: висічки сумарною масою 500 мг вiдбирали з 3 місць
бульб картоплi (верхівка, середина та пуповинна частина). Маса зразків
квіток дорівнювала 200-300 мг. Висічки бульб та зразки квіток мілко
нарізували, перемішували і ретельно розтирали на холоді ((0(С) в
порцеляновій чашці. В розтерту масу додавали 1 мл 5% оцтової кислоти.
Ретельно перемішували одержану масу і залишали її стояти протягом 2-х
годин. Після цього фільтрували масу, відбирали рідку фазу і підсушували її
в струмені теплого повітря. Одержанi рідкофазні зразки центрифугували (300
g), вiдбирали алiквоти рідкої фази об'ємом 20 мкл і наносили на металеву
(Au) поверхню зразконесучого диска приладу "МСБХ" (біохімічний мас-
спектрометр «МСБX» виробництва ВAТ SELMI, Суми, Україна) з наступною
реєстрацією мас-спектра (кiлькiсть вiдлiкiв 40000-200000); прискорююча
напруга + 10 кВ)(контроль).
Аналiз одержаного мас-спектра проводили за допомогою сервiсної
програми статистичної i математичної обробки спектрiв "МСБХ4" (НДI
радіаційної технiки та автоматизації, Москва). Мас-спектри мiстили пiки
квазимолекулярних iонiв (КМI) типу [М+Н]+, де М - молекулярна маса
аналізованої речовини (глiкоалкалоїду) в атомних одиницях маси (Да), Н –
протон, зокрема, (-чаконіну з молекулярною масою 851,0 Да вiдповiдає пiк
КМI з молекулярною масою 852,0; (-соланiну - з масою 868,0.
Виходячи з спiввiдношень iнтенсивностi КМI глiкоалкалоїдiв проводили визначення кiлькостi останнiх в зразках. Для кожного зразка екстракту глiкоалкалоiдiв квіток рослин картоплi проводили по три вимiрювання з наступним усередненням результатiв за допомогою сервiсної програми.
Глікоалкалоїди для отримання калібрувальної кривої отримували з етиольованих ротків картоплі шляхом багаторазової обробки: екстрагування 2% оцтовою кислотою, осадження 25% водним рочином аміаку з підігріваням на водяній бані до випадання осаду, центрифугування, відділення осаду від надосадкової рідини, розчинення осаду в 2% оцтовій кислоті і т.д. до тих пір, поки не будуть отримані чисті кристали глікоалкалоїдів.
Визначення рівня стiйкостi сортiв картоплi до фiтопатогенiв в
модельних системах in vitro визначали за методикою Кожушко Н.С., Чіванова
В.Д. [ ]. Модельна система для визначення кінетичних параметрів
деструкції глікоалкалоїдів складалась з 500 мг тканини бульби картоплі
гомогенізованої в 5 мл середовища інкубації - 0,17% розчинi оцтової кислоти
(pH 5,4-5,5), доповненої змiшаною польовою культурою грибiв Phytophthora
infestans та Fusarium oxysporum spp.[ ]. За контроль правила
гомогенізована тканина бульб в стерильному середовищі інкубації без
домішок. Iнкубували модельнi системи при 37оC в термостаті, вiдбираючи
зразки (100 мкл) на початку інкубації і в подальшому через 1, 2, 3, 4, 5 та
6 дiб. Одержанi зразки центрифугували, вiдбирали алiквоти рідкої фази
об'ємом 20 мкл, які аналізували як вказано вище.
3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Мас-спектрометрія PDMS досить давно з успіхом використовується з метою аналіза кількісного та якісного складу глікоалкалоїдів рослин картоплі різних сортів [ ].
Так, в якості прикладу наводимо типовий мас-спектр свіжого екстракту з гомогенату бульб картоплі сорту Невська (рис.2). Порівняльна інтенсивність піків КМІ іонів a-соланіну та a-чаконіну в цьому мас-спектрі відповідає реальному кількісному співвідношенню цих сполук в тканинах бульб картоплі даного сорту – відомо, що для всіх культурних видів картоплі відношення a-чаконін : a-соланін дорівнює 2(3) : 1. Останнє вірно у тому разі, якщо в тканинах рослини картоплі даного сорту гідролітичні ферменти є помірно активними, тобто не піддають швидкій деструкції глікоалкалоїди шляхом відщеплення кінцевих залишків моносахаридів.
Крім інтенсивних піків КМІ, що відповідають a-соланіну та a-чаконіну в
мас-спектрі присутні також «мінорні» пікі КМІ, які належать b-чаконіну
(молекулярна маса 706 Да) та аглікону глікоалкалоїдів – соланідіну
(молекулярна маса 398 Да)(рис.3). Зазначені сполуки виникають внаслідок
перебігу процесів ферментативноіхімічної деструкції інтактних молекул
глікоалкалоїдів, які супроводжуються вiдщепленням вiд молекули a-
чаконiну
L-Rha
Solanidine - D-Gal
(Mолекулярна маса 851 Да)
L-Rha залишку рамнози (L-Rha) з утворенням b-чаконіну:
Solanidine - D-Gal - L-Rha
(Mолекулярна маса 705 Да).
Подальша гідролітична деструкція b-чаконіну призводить до появи в
середовищі інкубації вільного соланідину з молекулярною масою 398 Да.
Незначна інтенсивність піків КМІ, що відповідають продуктам деструкції
свідчить про те, що внутрішньотканинні ферменти і в першу чергу
рамнозидаза, яка відщеплює кінцевий залишок рамнози від молекули
глікоалкалоїду, знаходяться в інтактних тканинах рослин картоплі в
неактивному стані. Як відомо, лише нативні молекули глікоалкалоїдів,
проявляють притаманні їм потужні фунгіцидні властивості щодо фітопатогенів
[ ]. Відповідно підвищення активності гідролітичних ферментів, індуковане
механічними або хімічними чинниками, призводить залежно від глибини
деструкційного процесу до часткової чи повної втрати глікоалкалоїдами
фунгіцидної активності. Одним з таких чинників є фітопатогени: добре
відомо, що бiохiмiчнi аспекти взаємодii фiтопатогенних грибiв з рослинними
клiтинами передбачають як ключову компоненту детоксифiкуючий вплив
спецiалiзованих ферментних систем грибiв на "захиснi" бiомолекули уражених
рослин, зокрема глікоалкалоїди. Так, Phytophthora infestans dB та Fusarium
oxysporum Schl. пiддають гiдролiтичнiй деструкцiї глiкоалкалоїди картоплi в
процесi iнвазiї, спричинюючи таким чином втрату ними фунгiцидних
властивостей [ ]. Дійсно, після 6-ти діб інкубації екстракта гомогенату з
бульб картоплі сорту Невська в присутності фітопатогенів мас-спектр значно
змінюється, а саме: інтенсивність піків КМІ a-соланіна і a-чаконіна різко
знижується з паралельним зростанням інтенсивності відповідних піків КМІ, що
належать b-чаконіну і соланідину (рис.3).
Якщо негативний вплив фітопатогенів «накладається» на притаманну
конкретному сорту картоплі підвищену активність рамнозидази та споріднених
ферментів, то сумація зазначених чинників створює оптимальні умови для
повної нейтралізації фунгіцидної активності глікоалкалоїдів за короткий
проміжок часу.
Рис.2. Мас-спектр екстракту з гомогенату тканин бульб картоплі сорту
Невська (контроль). Тут і на подальших рисунках інтенсивність піків КМІ надана в умовних одиницях (ум.од.) – кількостях відліків (стартів).
Рис. 3. Мас-спектр екстракту з гомогената тканин бульб картоплі сорту
Невська після 6-ти добової інкубації з фітопатогенами (Phytophthora infestans dB і Fusarium spp. (дослід).
Навпаки, сорти картоплі, рослинам яких притаманна низька активність
гідролітичних ферментів, протистоять фітопатогенам на протягом довшого
проміжку часу, і є, таким чином, порівняно стійкими щодо фітопатогенів.
Зважаючи на те, що ступінь активності ферментних систем є для сортів і
гібридів генетично обумовленою ознакою, ми висловили припущення про наявність безпосереднього зв’язку між швидкістю деструкції
молекул глікоалкалоїдів в тканинах рослини, обумовленою сумарною активністю
ферментних систем рослини і фітопатогенів і ступенем стійкості окремих
сортів картоплі до цих фітопатогенів. Нами досліджені кінетичні параметри
ферментативної гідролітичної деструкції глікоалкалоїдів тканин бульб
картоплі сортів Свiтанок київський, Невська, Молодiжна, та трансгенної
картоплі NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic які значно
різняться між собою за ступенем стійкості до фітопатогенів. Зокрема,
Світанок київський порівняно стійкий до Phytophthora infestans dB та
багатьох інших фітопатогенів; Невська, - середньостійка, а Молодіжна є
сортом, малостійким до фітопатогенів. Щодо рослин трансгенної картоплі, то
в літературі є свідчення на користь зниженого ступеня стійкості сортів
NewLeaf 6 Russet Burbank та NewLeaf 6 Atlantic по відношенню до збудників
хвороб.
Попередні експерименти з встановлення кількісних та якісних параметрів глікоалкалоїдів, притаманних рослинам трансгенних сортів картоплі, показали, що принципові відмінності останніх