Приложение № …

Описание некоторых лабораторно-практических работ, используемых при апробации спецкурса „Белок – основа жизни“.

I. Выделение белков из тканей и биологических жидкостей.

Цель: выявить содержание белков в тканях и биологических жидкостях.

1. Выделение казеина из молока.

Вариант I.

В химический стакан вместимостью 50 мл отмеривают цилиндром 3 мл молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают и добавляют 10-15 капель 1%-ного раствора соляной кислоты. Кислоту приливают аккуратно, по каплям, так как в избытке кислоты осадок растворяется.
Суспензию перемешивают, через 3-5 минут образуется рыхлый осадок.

Для удаления соляной кислоты в стакан добавляют 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют ещё на 5 минут. Жидкость осторожно сливают с осадка. К осадку ещё раз добавляют 10 мл дистиллированной воды, осторожно перемешивают содержимое стакана и через 5 минут фильтруют смесь через бумажный фильтр.

Доказательством того, что в состав казеина входит фосфор: осадок с фильтром переносят в широкую пробирку с обратным холодильником и добавляют
6 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Пробирку нагревают на песчаной бане в течение 1 часа. Жидкости дают остыть и нейтрализуют её концентрированной азотной кислотой до слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белка.

После отстаивания жидкость фильтруют и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию и молибденовую пробу на фосфорную кислоту. К 5 каплям гидролизата добавляют 10%-ый раствор NaOH и 2 капли 1%-ого раствора CuSO4.
Наблюдается фиолетовое окрашивание. К 10 каплям молибденового реактива добавляют 5 капель гидролизата и кипятят несколько минут. В присутствии
H3PO4 жидкость окрашивается в лимонно-жёлтый цвет. При охлаждении выпадает жёлтый кристаллический осадок комплексного соединения (NH4)3PO4(12MoO3.

Вариант II.

К 50-ти мл свежего молока добавляют равный объём насыщенного раствора сульфата аммония. При этом выпадают в осадок альбумины и казеин.
Отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр раствор альбуминов.

2. Получение раствора яичного альбумина.

Осторожно проделывают отверстие в скорлупе яйца с двух концов и выливают белок в стакан вместимостью 500 мл. В тот же стакан добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое стакана тщательно перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником.

Затем раствор переносят в мерный цилиндр, и объём раствора доводят до
300 мл добавлением дистиллированной воды. Раствор оставляют на 30 минут при комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов, затем разливают в пробирки по 20 мл.

20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через складчатый фильтр.
Фильтрат, содержащий яичный альбумин, используют для дальнейшей работы.

3. Выделение белков мяса.

Помещают в стакан 40-50 г пропущенного через мясорубку обезжиренного мяса, добавляют 80-100 мл 10%-го раствора NaCl и оставляют смесь стоять 15-
20 минут при частом помешивании. Отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр или через двойной слой марли окрашенную в красный цвет жидкость. В растворе содержатся главным образом, мышечный альбумин и глобулин.

4. Выделение растительных альбуминов.

25 грамм пшеничной муки смешивают со 100 мл дистиллированной воды, и смесь стряхивают в течение одного часа с помощью встряхивателя. Взвесь муки центрифугируют и надосадочную жидкость фильтруют через складчатый фильтр.
Отфильтрованный прозрачный раствор содержит преимущественно альбумин пшеничных зёрен.

II. Реакции осаждения белков.

Цель: выявить влияние различных органических и неорганических веществ на осаждение белков. Изучить физические свойства белков.

1. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

В три сухие пробирки наливают по 1-2 мл концентрированной HNO3, H2SO4,
HCl. Затем, наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке добавляют из пипетки по 0,5 мл исследуемого раствора белка, так чтобы он не смешивался с кислотой. Вместе соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный осадок белка. При встряхивании осадок, выпавший при действии HNO3, увеличивается, а осадки выпавшие при действии HCl и H2SO4, растворяются в их избытке.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимые осаждения белков. Это связано как с дегидратацией белковых молекул, так и с денатурацией белка.

2. Осаждение белков органическими кислотами.

В две пробирки добавляют по 2-3 мл раствора белка и добавляют в одну из них несколько капель 5%-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), а в другую – несколько капель 20%-го раствора сульфосалициловой кислоты. В обоих случаях наблюдается выпадение осадка белка. Сульфосалициловая и ТХУ кислоты являются чувствительными и специфическими реактивами на белок.

ТХУ кислота осаждает только белки и не осаждает продукты распада белка и аминокислоты, поэтому ею пользуются часто для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, сыворотки крови).

3. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

В две пробирки добавляют по 1-1,5 мл исследуемого пастора белка, по каплям при встряхивании, добавляют в одну из них раствор CuSO4, а другую –
Pb(CH3COO)2. Выпадает хлопьевидный осадок вследствие образования малорастворимого солеобразного соединения (с солью меди – голубого цвета).
При избытке реактива осадок снова растворяется.

Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде соединения. Потому что белки применяют в качестве противоядия при отравлении, например, ртутными солями (сулема).

III. Гидролиз белка.

Цель: дать учащимся представление о кислотном, щелочном и ферментативном гидролизе белка. Опытным путём установить продукты распада белковой молекулы.

1. Кислотный гидролиз простого белка.

При гидролизе белки распадаются сначала на высокомолекулярные продукты
– пептоны, затем на полипептиды и, наконец, на аминокислоты.

Для гидролиза отмеривают в круглодонную колбу 20 мл раствора яичного белка и 5 мл концентрированной HCl. Колбу закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой. Кипятят содержимое колбы под тягой в течение 45 или 90 минут.

Открытие промежуточных продуктов распада белка в гидролизате при помощи биуретовой реакции. Промежуточные продукты распада белка – пептоны – при проведении биуретовой реакции дают розовое или красное окрашивание, а белки – сине-фиолетовое.

2. Ферментативный гидролиз белка.

Подготовительный этап: белок куринового яйца развести 1:1 водой и раствор белка влить в кипящую воду (V=100 мл) при помешивании.

В две пробирки налить по 2 мл приготовленного раствора белка. В первую добавить 1 мл дистиллированной воды, во вторую – 1 мл 1%-го раствора пепсина. Обе пробирки поставить в водяную баню при t=37-40 0C на 15 минут.
Проделать биуретовую реакцию с содержимым обеих пробирок.

В воде окраска более интенсивная (фиолетовая с синим оттенком), так как при гидролизе осталось больше пептидных связей, чем в случае с пепсином
(окраска менее интенсивная – фиолетовая с розовым оттенком) – меньше пептидных связей.

В присутствии пепсина гидролиз идёт интенсивнее, чем в присутствии воды.

IV. Денатурация белков.

Цель: определить факторы, вызывающие денатурацию белка.

4.1. В три пробирки наливают по два мл раствора белка куриного яйца, предварительно разведённого 1:20 и профильтрованного через двойной слой марли.

В первую пробирку наливают насыщенный раствор сульфата аммония; во вторую – концентрированную HNO3; в третью – этиловый спирт. Белок свёртывается во всех пробирках.

4.2. В три пробирки добавляют по 2 мл раствора белка. Во вторую добавляют одну каплю 1%-го раствора уксусной кислоты; в третью – одну каплю
10%-го раствора NaOH. Все три пробирки нагревают над пламенем спиртовки.

В первой пробирке (pH=7) образуется осадок белка, вследствие его денатурации при нагревании, во второй пробирке осадок образуется быстрее и полнее вследствие нейтрализации белка в слабокислой среде; в третьей пробирке (pH>7) осадка не образуется даже при кипячении.

V. Качественные реакции на белки.

(Цветные реакции на белки; определение аминокислотного состава белков).

Цель: Путем качественных реакций определить наличие пептидных связей и
NH2 – групп в молекулах белков; выявить аминокислотный состав белков.

1. Обнаружение в молекулах белков пептидных связей (биуретовая реакция).

К 1-2 мл разбавленного белка добавляют двойной объем 30%-ного раствора
NaOH хорошо перемешивают и приливают 2-3 капли 1%-ного раствора CuSO4.
Снова тщательно перемешивают. Развивается красно-фиолетовое окрашивание.
(Химизм реакции см. на стр.…).

2. Нингидриновая реакция.

К 2-3 мл разбавленного раствора белка приливают 3-4 капли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и ставят в водяную баню при t=70 0С на несколько минут. Развивается сине- фиолетовое или розово-фиолетовое окрашивание.

Нингидриновая реакция доказывает наличие NH2 – групп в белках (химизм реакции на стр.…).

3. Ксантопротеиновая реакция (реакция на ароматические аминокислоты: фенилаланин, тирозин, триктофан).

В одну пробирку добавляют 5 капель раствора яичного белка, во вторую – раствора желатина, в третью – раствора миозина. Во все пробирки приливают по 3-5 капель концентрированной HNO3 и нагревают. В первой и третьей пробирках образовался белый осадок, который при нагревании окрашивается в желтый цвет и постепенно растворяется в (происходит гидролиз белка), сообщая желтую окраску раствору. Желатина, не содержащая ароматических аминокислот, не дает ксантопротеиновой пробы. Образование желтых пятен на коже при попадании концентрированной HNO3 обусловлено этой реакцией (химизм реакции на стр.…).

4. Реакция на тирозин (реакция Миллона).

Реакция обусловлена наличием в белках аминокислоты тирозина. При нагревании или продолжительном стоянии раствора белка с реактивом Миллона
(раствор нитратов ртути (I) и (II) в HNO3 с примесью HNO2) образуется осадок, окрашенный сначала в розовый, а затем в кроваво-красный цвет.

В 4 пробирки наливают по 5 капель: в первую – раствора яичного белка, во вторую – раствора желатина; в третью – раствора миозина; в четвертую – раствора тирозина. Во все 4 пробирки добавляют по 2-3 капли реактива
Миллона и осторожно нагревают. Наблюдают происходящие изменения (химизм реакции на стр.…).

5. Реакция на цистеин (реакция Фоме).

В первую пробирку приливают 5 капель 1%-ного раствора яичного белка, во вторую – 1%-ного раствора желатины, в третью – раствора миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 30%-ного раствора NaOH и по 1 капли
5%-ного раствора ацетата свинца. При интенсивном кипячении жидкость в пробирках с яичным белком и миозином темнеет, так как образуется черный осадок сульфида свинца. В пробирке с раствором желатина черного осадка не образуется, так как данное вещество не содержит серосодержащих аминокислот
(химизм реакции на стр.…).

6. Реакция на аргинин (реакция Сакагути).

В первую пробирку приливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую
– раствора желатина, в третью раствора миозина. Во все пробирки добавляют несколько кристаллов резорцина, 1 мл 3%-ного раствора H2O2 и осторожно по стенке приливают 1 мл концентрированной серной кислоты. Через некоторое время на границе раздела (белок – кислота) развивается оранжевое окрашивание (химизм реакции см. на стр.…).

7. Реакция на триптофан (реакция Шульце-Распайля).

В пробирку с раствором белка приливают 2 капли раствора сахарозы и 1 мл концентрированной серной кислоты, следя, чтобы жидкости не смешивались.
На границе раздела жидкостей появляется вишнево-красное окрашивание.

Суть: под влиянием серной кислоты происходит гидролиз сахарозы до моносахаридов, которые обезвоживаются, превращаясь в оксиметилфурфурол.

8. Реакция на гиспеидин и тирозин (реакция Паули).

В пробирку с раствором белка приливают 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты, 2 мл NaNO2, переливают и добавляют 2-4 мл 10%-ного раствора Na2CO3.

После смешивания раствор окрашивается в вишнёво-красный цвет (химизм реакции см. на стр.…).

Приложение № …

Конспект урока – лекции.

Тема: „Химический состав организмов. Общее знакомство с белками“.

Цель: изучить химический состав организмов. Определить значение белков в осуществлении процессов жизнедеятельности, выявить особенности функционирования белковых тел как носителей жизни.

Задачи:

1. Образовательные: познакомить учащихся с химическим составом организмов: макроэлементы, микроэлементы, ультраэлементы.

Определить место белков в жизненных процессах, выявить их значение и особенности функционирования как носителей жизни. Изучить элементный состав белков.

2. Развивающие: довести до сознания учащихся необходимость изучения белковых тел. Развить понятие „белок“. Формирование интеллекта, мышления учащихся, правильного понимания жизненных процессов.

3. Воспитательные: воспитание научного мировоззрения; эстетическое, экологическое, нравственное воспитание.

Тип урока: изучение нового материала.

Методы:

- словесные (лекция);

- наглядные (демонстрация таблиц „Элементарный состав белков“,

„Первичная структура молекулы инсулина быка“, „Аминокислоты, постоянно встречающиеся в составе белков“, демонстрация модели белка гемоглобина).

Структура урока:

I. Вводная часть.

- подготовка учащихся к уроку;

- подготовка к восприятию нового материала.

II. Изучение нового материала.

- изучение нового материала;

- запись выводов в тетрадь.

III. Заключительная часть.

- выявление понимания изученного материала;

- домашнее задание.
План урока:

1. Химический состав организмов.

2. Значимость проблемы изучения белков.

3. Особенности белковых тел как носителей жизни.

4. Общее знакомство с белками.
Ход урока:

I. Водная часть.

- подготовка учащихся к уроку;

- сообщение темы и цели урока.

II. Изучение нового материала.

1. Химический состав организмов.
Вопрос учащимся:

1. Как вы считаете, какие химические элементы входят в состав живых организмов?

2. Какие из них встречаются в наибольшем количестве?

В организмах, составляющих биомассу Земли, обнаружено свыше 60 химических элементов. Среди них имеется группа элементов, постоянно встречающихся в составе любого организма, независимо от систематической принадлежности и уровня организации последнего. К их числу относятся: C, N,
H, O, S, P, K, Ca, Mg, Zn, Fe, Mn, Cu, и Co. Остальные элементы, обнаруженные в биомассе, принадлежат к категории иногда встречающихся; их присутствие характерно лишь для некоторых групп организмов. Наиболее распространенными из них являются Mo, B, V, Na, J, Cl и некоторые другие.

По количественному содержанию в живом веществе элементы делят на три категории: макроэлементы, концентрация которых превышает 0,001% (O, C, H,
Ca, K, N, P, S, Mg, Na, Cl и Fe), микроэлементы, доля которых составляет от
0,001% до 0,00001% (Mg, Zn, Cu, B, Mo, Co, и многие другие), и ультраэлементы, содержание которых не превышает 0,000001% (Hg, Au, U, Ra, и др.).

Многочисленные макро- и микроэлементы, образующие живую материю, присутствуют в ней в виде разнообразных химических соединений.

Примерно 75% биомассы составляет вода. Вода играет огромную роль в создании условий для жизнедеятельности. Она образует ту среду, в которой протекают физико-химические процесс, обеспечивающие постоянное возобновление живого вещества. Вторым по количественному содержанию в биологических объектах, но, несомненно, первым и главным по значению классом соединений являются белки. В среднем можно принять, в сухом веществе организмов содержится 40-50% белка, причем растительному миру свойственно отклонение от этой средней величины в сторону понижения, а животному – повышения. Микроорганизмы обычно богаче белком (некоторые же вирусы являются почти чистыми белками). Таким образом, в среднем можно принять, что 10% биомассы на Земле представлено белком, то есть его количество измеряется величиной порядка 1012 - 1013 тонн. Остальные 50% сухого вещества организмов составлены соединениями других классов. Это – углеводы, ликиды и минеральные вещества, содержание которых в организмах сильно варьирует.

2. Значимость проблемы изучения белков.

В природе насчитывается 1012 разных белков. Они обеспечивают жизнь более 2 млн. видам организмов.

Ни одно вещество из всех веществ биологического происхождения не имеет столь большого значения и не обладает столь многогранными функциями в жизни организма как белки.

Ф. Энгельс писал: „Повсюду, где мы встречаем жизнь, мы находим, что она связана с каким-либо белковым телом и повсюду, где мы встречаем какое- либо белковое тело, которое не находится в процессе разложения, мы без исключения встречаем и явления жизни“.

Почему именно белки являются материальным субстратом жизни?

Потому, что они обладают рядом особенностей, которые несвойственны никаким другим органическим соединениям.

3. Особенности белковых тел как носителей жизни.

1) бесконечное разнообразие структуры и вместе с тем высокая видовая специфичность её;

2) крайнее многообразие физических и химических превращений;

3) способность к внутримолекулярным взаимодействиям;

4) способность отвечать на внешнее воздействие закономерным изменением конфигурации молекулы.

5) Склонность к взаимодействию с другими химическими соединениями с образованием надмолекулярных комплексов и структур;

6) Наличие биокаталитических свойств и ряд других качеств.

Только детально изучив строение белков и их свойства, можно понять как указанные особенности белков, так и их функции.

4. Общее знакомство с белками.

Белки – это высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, полифункциональные амфотерные электролиты, молекулы которых состоят из остатков аминокислот.

Элементный состав белков:

C – 50 – 55%; H – 7 – 8%;

O – 21 – 25%; S – 1 – 2%;

N – 16%; P – менее 1%.

Особенно характерный показатель – процентное содержание азота. В большинстве случаев оно составляет 16%, поэтому по содержанию белкового азота часто вычисляют содержание белка в кормах и продуктах питания. Для этого величину, выражающую процентное содержание белкового азота в препарате, умножают на фактор пересчета, равный 6,25, который выводят путем деления: 100:16 = 6,25.

Белки кроме основных химических элементов включают и другие химические элементы. Например, гемоглобин содержит железо, ферменты – оксидазы содержат медь, ДНК-аза – кальций; РНК-аза – магний и др.

Молекула белка состоит из одной или нескольких полипептидных цепей, которые состоят из большого числа остатков аминокислот (протеиногенных кислот). В природе насчитывается свыше 200 различных аминокислот. Из них только 20 – белковые (18 аминокислот + 2 амида: аспарагин и глутамин).

Общая формула белка:

O O

|| ||

NH2 – CH – C – N – CH – C – N – CH – COOH

| | | | |

R H R H R n

Опорный конспект

60 химических элементов

|ОРГАНИЗМ |
|(микро – растительный, животный) |

Макро - Микро - Ультра –

Э Л Е М Е Н Т Ы

O, C, H, Ca, K, N, Mn, Zn, Cu, B, Hg, Au, U, Ra и др.
P, S, Mg, Na Mo, Co, и др.

|Сухое вещество организмов |

40 – 50% остальные 50% белки углеводы, липиды, минеральные вещества

в природе 1012 в одной клетке до 3000
|белок |

C, O, N, H, S, P 18 а.к + 2 амида

+ 20 другие химические элементы
(Pe, Cu, Mg, Ca, и др.).

III Заключительная часть

- запись опорного конспекта в тетрадь;

- домашнее задание: записи в тетрадях, подготовка к семинарскому занятию.

Литература для подготовки к семинарскому занятию:

1. Андреева Е.В. Химия жизни. – Л.: Детская литература, 1967.

2. Асатиани В.С. Химия нашего организма. – М.: Наука, 1969.

3. Макаров К.А. Химия и здоровье: Книга для внеклассного чтения учащихся 8 – 10 классов средней школы. – М.: Просвещение, 1985.

4. Шамин А.Н. История биологической химии. – М.: Наука, 1994.

5. Шульпин Г.Б. Химия для всех. – М.: Знание, 1987.

Приложение №…

Конспект лабораторно – практической работы „Выделение белков из тканей биологических жидкостей“.

Цель: формирование практических умений, совершенствование знаний полученных при изучении темы „Методы выделения белков“.

Задачи:

1. Образовательные: углубить, расширить и систематизировать знания учащихся опираясь на основные понятия темы. Дать работу по вариантам. Четко сформулировать вопросы. Познакомить учащихся с техникой выполнения работы. Дать рекомендации по её выполнению.

2. Развивающие: познакомить учащихся с некоторыми методическими приемами, используемыми при выделении белков из тканей и биологических жидкостей. Сформулировать практические умения работы с химическим оборудованием, химическими реактивами и биологическими объектами. Развитие интеллекта, мышления учащихся, развитие умения делать выводы на основе полученных результатов.

3. Воспитательные: воспитание научного мировоззрения на основе выполненной работы сделанных выводов, эстетическое, экологическое и нравственное воспитание.

Тип урока: совершенствование знаний.

Методы:

- словесные (рассказ, беседа);

- наглядные (демонстрация таблиц);

- наглядно – действенные (выполнение лабораторно – практической работы).

Оборудование: цилиндры, химические стаканы на 50 и 500 мл, пробирки, стеклянные палочки с резиновыми наконечниками, складчатые фильтры, марли, обратный холодильник.

Реактивы: 1% раствор HCl; концентрированная азотная кислота; 10% раствор NaOH; 1% раствор сульфида меди; насыщенный раствор (NH4)2SO4; дистиллированная вода; 10% раствор NaCl.

Материал, содержащий белок: молоко, куриное яйцо, обезжиренное мясо, пшеничная мука.

Структура урока:

I. Вводная часть.

II. Главная часть.

III. Заключительная часть.

Подготовительный этап: работа проводится по группам (всего три группы). За урок до лабораторно-практического задания учитель делит класс на группы, определяет тему лабораторно-практической работы для каждой группы и раздает карточки – инструкции для ознакомления учащихся с ходом работы.

Предварительно учитель и лаборант готовит необходимые реактивы и оборудование.

Ход урока:

I. Вводная часть.

- подготовка учащихся к уроку;

- выяснение техники проведения эксперимента у каждой группы

(последовательность выполнения действий, ожидаемый результат, техника безопасности).

II. Главная часть.

- выполнение лабораторно-практической работы:

I вариант (группа) - „Выделение казеина из молока“.

II вариант (группа) - „Получение раствора яичного альбумина“,

„Выделение растительных альбуминов“.

III вариант (группа) - „Выделение белков мяса“.
(Описание лабораторно-практических работ см. в приложении №…).
Учитель следит за ходом выполнения работы каждой группы, подсказывает, замечает ошибки.

III. Заключительная часть.

- краткая запись хода работы;

- формулирование выводов;

- учитель отмечает положительные и отрицательные моменты выполнения работы.