Министерство образования Российской Федерации

Уральский Государственный Технический Университет – УПИ

Кафедра Технологии органического синтеза

РЕФЕРАТ:

РОЛЬ ВИРУСОВ И ПЛАЗМИД В ОПУХОЛЕОБРАЗОВАНИИ

Выполнил: студент гр. Х-449

Покровский П.В.

Екатеринбург

2001

1. Введение

Возникновение злокачественных (раковых) опухолей может иметь различные причины, однако во всех случаях к этому причастен генетический материал клетки – ее ДНК. Что бы ни привело к образованию опухоли (раковому перерождению), последующим ростом ткани управляет ДНК безудержно делящихся опухолевых клеток. В основе превращения нормальной клетки в злокачественную
– опухолевой трансформации – лежит перенос или иное изменение ДНК. Агент, вызывающий пролиферацию клеток, - это продукт гена. До сих пор, правда, не удается создать общую теорию, которая охватывала бы все формы ракового перерождения, однако изучение злокачественных опухолей, вызванных вирусами и плазмидами, уже сейчас позволяет сделать далеко идущие выводы.

Мы рассмотрим три примера онкогенеза: 1) образование опухолей у растений, 2) развитие опухолей у животных под воздействием ДНК-вирусов и 3) развитие опухолей у животных под воздействием РНК-вирусов (ретровирусов).

2. Образование опухолей у растений.

У многих растений встречаются опухоли корневой шейки. Эти разрастания ткани уменьшают поток питательных веществ между подземными и надземными частями. У многих растений такие опухоли можно вызвать экспериментально; типичные результаты получаются больше чем у половины изученных видов (рис.
1). Возбудителем является Agrobacterium tumefaciens – грам-отрицательная почвенная бактерия с перитрихальными жгутиками, сходная с представителем рода Rhizobium. Бактерии проникают в ткань через поврежденные участки и размножаются в межклетниках. Бывают вирулентные и авирулентные штаммы A. tumefaciens; вирулентные содержат большую плазмиду, так называемую Ti- плазмиду (Ti – Tumor Inducing, индуцирующая опухоль). После заражения ткани плазмиды проникают в растительные клетки.

Плазмидная ДНК прочно интегрируется в хромосомную ДНК растительных клеток и вызывает их опухолевый рост. Путем прививки таких клеток можно передать опухоль здоровому растению; таким образом, после того как клетки претерпели опухолевую трансформацию, бактерия и ее плазмида становятся уже ненужными. Интегрированная ДНК плазмиды ответственна также за способность клеток вырабатывать новые ферменты, с помощью которых синтезируются аминокислоты октопин и нопалин, так называемые опины. Эти аминокислоты могут использоваться бактерией A. tumefaciens в качестве источника углерода и азота. Благодаря Ti-плазмиде Agrobacterium получает, таким образом, преимущественный доступ к продуктам фотосинтеза растения: Ti-плазмида обеспечивает образование аминокислот, которые могут быть усвоены только этой бактерией.

Наряду с этим Ti-плазмида представляет собой естественный генный вектор для переноса чужеродной ДНК в растения. Гены, определяющие опухолевый рост, можно выделить из плазмиды и заменить другими генами. Из тканей, состоящих из клеток, трансформированных видоизмененной плазмидой, удавалось регенерировать целые растения табака, которые росли совершенно нормально и вдобавок ко всему синтезировали опины. Таким образом, гены чужеродной ДНК передавались как доминантные факторы в соответствии с обычными законами наследственности.

Поиски путей введения чужеродных генов в клетки высших растений интенсивно ведутся во всем мире с начала 70-х годов. Одним из импульсов к развитию методов переноса чужеродных генов в растения стали результаты детального изучения молекулярно-генетических основ опухолевого роста у растений при участии бактерий рода Agrobacterium. В результате этих исследований оказалось, что опухолеобразующие плазмиды агробактерий, представляющие собой мини-кольцевые ДНК, являются природной векторной системой, которую сейчас используют для переноса генов в растения. Плазмида агробактерии переносит часть своей ДНК в ДНК растительной клетки, в ДНК встраивается "нужный" ген. С помощью этого уникального вектора уже получено большое число трансгенных растений. Важно также то, что методы генной инженерии сейчас используют не только в практике, это важнейшая методология для познания фундаментальных основ организации и функционирования растительного генома.

2.1. ЧТО ТАКОЕ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

Генетическая инженерия - это система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК. Суть генетической инженерии сводится к переносу в растения чужеродных генов, которые могут сообщать растениям полезные свойства. Такие манипуляции осуществляются с помощью соответствующих ферментов - рестрикционных эндонуклеаз, расщепляющих молекулы ДНК в строго определенных участках, и лигаз, сшивающих фрагменты в единую рекомбинантную молекулу ДНК.

Итак, процедуры генетической инженерии сводятся к тому, что из набора фрагментов ДНК, содержащих нужный ген, собирают гибридную структуру, которую затем вводят в клетку. Введенная генетическая информация экспрессируется, что приводит к синтезу нового продукта. Таким образом, вводя в клетку новую генетическую информацию в виде гибридных молекул ДНК, можно получить измененный организм.

Растения имеют одно очень важное преимущество перед животными, а именно возможна их регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, фертильных (способных завязывать семена) растений. Это свойство (тотипотентность) открывает для молекулярных биологов большие возможности в изучении функционирования генов, введенных в растения, а также используется в селекции растений. Для конструирования растений необходимо решить следующие задачи: выделить конкретный ген, разработать методы, обеспечивающие включение его в наследственный аппарат растительной клетки, регенерировать из единичных клеток нормальное растение с измененным генотипом. Таким образом, методология генетической инженерии в отношении растений направлена на коренное изменение методов традиционной селекции, с тем чтобы желаемые признаки растений можно было получать путем прямого введения в них соответствующих генов вместо длительной работы по скрещиваниям.

Формальной датой рождения генетической инженерии растений является полученное с помощью Ti-плазмидного вектора первое в мире химерное растение санбин (sunbeen) как результат переноса гена запасного белка бобовых
(фазеолина) в геном подсолнечника (sunflower + been). Это было первым ощутимым, хотя, быть может, и несовершенным свидетельством того, что в отношении растений генетическая инженерия сможет оправдать надежды специалистов в области молекулярной генетики, биологии и селекции.

2.2. КОРОНЧАТЫЕ ГАЛЛЫ РАСТЕНИЙ

В группе почвенных бактерий, известных под общим названием
Agrobacteria, есть несколько видов, которые могут заражать растения и вызывать образование опухолей, называемых корончатыми галлами, состоящими из недифференцированной опухолевой ткани, растущей в месте заражения.
Клетки корончатых галлов во многих отношениях напоминают раковые клетки животных. Они приобретают способность к неограниченному, нерегулируемому росту. Когда клетки корончатых галлов культивируют in vitro, они растут при отсутствии специальных гормонов, которые необходимы при культивировании нормальных растительных клеток. Более того, клетки корончатых галлов продолжают сохранять эти свойства (трансформированный фенотип), даже если убить бактерии антибиотиками. Изучение индуктора опухолей Agrobacterium tumefaciens показало, что собственно опухолеродным агентом у этой бактерии является Ti-плазмида, которая частично интегрируется в хромосомы растений.

2.3. АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ: Ti-ПЛАЗМИДЫ

В A. tumefaciens помимо хромосомы содержится Ti-плазмида. Плазмида содержит Т-ДНК (transferred DNA), которая составляет 12-22 тыс. пар оснований и встраивается в ДНК растительной хромосомы. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов - производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии.

Кроме Т-ДНК в Ti-плазмиде содержатся vir-область, отвечающая за перенос
Т-ДНК в растение, гены утилизации опинов, а также локусы, контролирующие размножение плазмиды в бактериальной клетке и ее перенос при бактериальной конъюгации. Доказательства того, что именно Ti-плазмиды, а не хромосомные гены бактерий ответственны за поддержание трансформированного состояния клеток корончатых галлов, были получены при изучении штаммов Agrobacterium, содержащих мутантные Ti-плазмиды. Агробактерии, лишенные Ti-плазмид, не индуцируют в зараженном растении ни образования корончатых галлов, ни синтеза опинов. Все полученные мутации Ti-плазмид разделяют на три основных класса. Мутанты первого класса не индуцируют синтез опинов, но вызывают образование корончатых галлов. Мутанты второго класса утрачивают способность индуцировать развитие опухолей. Мутанты третьего класса стимулируют аномальную дифференцировку нормальных клеток, например избыточный рост корней или побегов. Эти генетические исследования показали, что ДНК Ti-плазмид содержит гены, которые контролируют развитие опухолей, синтез опинов. Поскольку у растений с мутантными Ti-плазмидами второго и третьего классов с помощью фитогормонов можно стимулировать опухолеобразование, было предположено, что полученные мутации затрагивают гормональный метаболизм.

2.4. КАКИЕ ГЕНЫ ЛОКАЛИЗОВАНЫ В Т-ДНК

В области Т-ДНК картировано не менее шести генов, отвечающих за морфологию опухоли и синтез фитогормонов. Ген iaaM 1 кодирует фермент триптофан-2-монооксигеназу, которая переводит триптофан в индолилацетамид.
Ген iaaH 2 кодирует гидролазу, превращающую индолилацетамид в гормон растений ауксин - индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Совместная деятельность продуктов генов 1 и 2 обусловливает появление в растениях несвойственного им пути образования природного ауксина, что в целом приводит к изменению количества ауксина в клетках растения. Изопентенилтрансфераза, кодируемая геном ipt, катализирует ранние стадии биосинтеза природного цитокинина.
Гены iaaM, iaaH и ipt представляют собой онкогены, так как продуктами этих генов являются фитогормоны ауксин и цитокинин, которые индуцируют деление клеток. Ген 5 отвечает за синтез индол-3-лактата, который является продуктом превращения ауксина. Этот метаболит проявляет антиауксиновый эффект. Ген tml 6 влияет на величину опухоли; транскрипт 6а необходим для секреции нопалина и октопина, а ген 6б изменяет чувствительность растительных тканей к цитокинину и сохраняет клетки в недифференцированном состоянии. Итак, четыре или, возможно, пять генов подавляют дифференцировку опухолевых клеток и переводят их в состояние деления, а еще один ген кодирует фермент, катализирующий синтез опинов.

2.5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

Процесс трансформации можно разделить на четыре этапа: прикрепление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т-ДНК внутрь клетки растения, интеграция Т-ДНК в геном растения и экспрессия Т-ДНК.

Индукция начальных этапов трансформации может происходить только в месте раневого повреждения растения, где выделяются низкомолекулярные фенольные соединения (например, ацетосирингон), углеводы (например, глюкоза и глюкуроновая кислота) и где образуется кислый рН. Весь процесс вырезания и интеграции Т-ДНК в растительную хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Восприятие раневых сигналов осуществляют белки VirA и ChvE. ChvE, белок, кодируемый хромосомным геном бактерии, чувствует присутствие ацетосирингона и изменяет способность VirA отвечать на фенольные соединения. VirA является гистидиновой протеинкиназой, способной к аутофосфорилированию, он дважды пронизывает внутреннюю мембрану бактериальной клетки и выступает в качестве донора фосфора белку VirG.
Фосфорилированный VirG активирует транскрипцию остальных vir-генов.
Индукция vir-генов обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин - больной и нежизнеспособный организм, перенос Т-ДНК не осуществляется.

Оперон VirD кодирует несколько продуктов. Один из них является двухкомпонентной эндонуклеазой. Область Т-ДНК окружена одинаковыми повторами длиной 25 пар оснований. Эти последовательности являются сайтами узнавания VirD-эндонуклеазы, режущей точно между 3-м и 4-м основаниями 25 пар оснований повтора. Эта эндонуклеаза ответственна за вырезание Т-ДНК.
Белки VirB и VirE необходимы для транспорта Т-ДНК из бактерии в растение.
Перенос Т-ДНК из бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин.

Внедрение Т-ДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом. Недавние результаты анализа нуклеотидных последовательностей в участках растительной ДНК, в которые инкорпорируется Т-ДНК, показали, что есть гомология между растительной ДНК по обеим сторонам от места встраивания и наружными областями плазмидной ДНК агробактерий. В геном растения могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромосому Т-ДНК становится обычной частью генома растения. Т-ДНК транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения- хозяина. Транскрипты имеют особенности эукариотических матриц. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины - источник азота и углерода.

2.6. ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРА

Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во- первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков. Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы
(регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены.

Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения состоит в том, чтобы заразить его A. tumefaciens, содержащей подходящую Ti-плазмиду, и предоставить дальнейшее естественному ходу событий. Необходимо только уметь встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды. Однако размеры целой Ti- плазмиды существенно больше размеров молекул, обычно используемых в работе с рекомбинантной ДНК. Чтобы преодолеть эту трудность, разработан следующий подход. Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в клетках бактерий - Escherichia coli. E. сoli содержит плазмиду pBR322, которая способна к саморепликации, то есть размножению, приводящему к увеличению числа ее копий. После того как в плазмиду pBR322 внедрили участок Ti-плазмиды, это рекомбинантная структура может затем реплицироваться многократно, что приводит к увеличению числа копий участков
Ti-плазмиды. Этот процесс называется клонированием. Бактерии, содержащие плазмиду pBR322 с участком Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем с использованием рестриктаз и стандартных приемов работы с рекомбинантной ДНК в Т-сегмент встраивают определенный ген. Этот молекулярный гибрид, теперь уже содержащий Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в E. сoli, а затем вводят в клетки A. tumefaciens, несущие соответствующую полную Ti-плазмиду. В результате обмена идентичными участками (гомологичная рекомбинация) между Т-сегментами нативной и сконструированной Ti-плазмид Т-ДНК со встроенным чужеродным геном включается в Ti-плазмиду, замещая нормальную Т-ДНК. Таким образом, мы получаем клетки A. tumefaciens, несущие Ti-плазмиду со встроенным в Т- сегмент нужным геном. Последний этап заключается в заражении растений этими модифицированными генно-инженерными методами агробактериями. Клетки полученных трансгенных растений будут содержать интегрированную Т-ДНК со встроенным чужеродным геном, то есть цель работы, состоявшая во введении данного гена в геном растения, будет достигнута. Недавние исследования, однако, показали, что эту процедуру можно упростить, если использовать бинарные векторные системы, создание которых заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней мере две разные модифицированные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только vir- область, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Такие плазмиды называют плазмидами-помощницами. Вторая Ti-плазмида должна содержать область Т-ДНК с нужным встроенным геном. Продукты vir-генов способны вырезать Т-ДНК как на собственной плазмиде, так и на соседней, то есть vir- гены могут работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений.

В целом идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна: 1) содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений; систему для экспрессии чужеродных генов в растениях
(узнаваемый растительными полимеразами промотор), маркер, который необходим для селекции трансформированных клеток; 2) не содержать онкогенов, то есть генов, которые подавляют дифференцировку растительных клеток. Второй пункт достигается с помощью транспозонного мутагенеза (транспозон - последовательность ДНК, способная перемещаться по геному). В результате введения транспозона в Т-ДНК можно выключить гены, которые приводят к опухолеобразованию (iaaM, iaaH, ipt), что не отражается на механизме переноса Т-ДНК. Обычно используют бактериальные транспозоны (Tn5, Tn7). При этом снимается блок с процессов регенерации. При модификации Ti-плазмиды необходимо предусмотреть также наличие уникальных сайтов рестрикции, в которые будет клонирован чужеродный фрагмент ДНК. Такие уникальные сайты рестрикции создаются включением в искусственные Ti-конструкции последовательностей, которые содержат множественные сайты разрезания для рестриктаз EcoR1, Hind III, BamH1 и др. В некоторых случаях в одном множественном сайте имеется 18-20 сайтов, узнаваемых разными рестриктазами, почему эти участки и называются полилинкерами.

Кроме того, при конструировании векторных молекул должно быть предусмотрено наличие промоторов, работающих в растениях. Промотор
(участок, к которому присоединяются РНК-полимеразы) должен обладать набором свойств, а именно: силой (активной экспрессией), возможностью регуляции, ткане- и органспецифической экспрессией. Так, например, к регулируемым промоторам относится промотор генов белков теплового шока (генов, активность которых индуцируется при повышенной температуре), а тканеспецифичная экспрессия характерна для генов, контролирующих синтез запасных белков, например зеина, который обнаружен только в тканях семян злаков. Наиболее популярным является промотор гена вируса мозаики цветной капусты (CAMV). Гены, подшитые к такому промотору, активно экспрессируются во всех тканях.

Наконец, в векторе должны быть предусмотрены маркеры, с помощью которых возможен отбор трансгенных растений. В литературе маркерные гены еще называют репортерными. Их достаточно много. Например, luxA и luxB - это гены, выделенные из ДНК светлячков. Они контролируют синтез люциферазы, которая обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в основную, что и обеспечивает свечение. В последнее время пользуется популярностью другой репортерный ген - pgfp, который контролирует синтез GFP-белка (green fluorescent protein). Этот ген был выделен из ДНК медузы Acquorea victoria.
Трансгенные растения с этим геном светятся в ультрафиолете зеленым светом.

Традиционный способ трансформации растительных клеток с помощью Т-ДНК заключается в нанесении агробактерий, содержащих Ti-плазмиду, на специально поврежденный побег. Сейчас используют широкий арсенал методов для получения трансгенных растений. Создан даже специальный прибор - "Shotgun", который стреляет мельчайшими вольфрамовыми пульками, одетыми в молекулы ДНК, осуществляя таким образом трансформацию растительных клеток.

2.7. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ С

ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Ti-ПЛАЗМИД

Еще несколько лет назад ученые задавали вопрос, можно ли создать сорта, сбалансированные по составу аминокислот, устойчивые к холоду, засухе, не поражаемые вредителями. Сегодня можно с уверенностью утверждать, что такие трансгенные растения уже вышли в поле. По литературным данным, к 1997 году в 30 странах мира проведено более 3 тыс. полевых испытаний. В этих экспериментах использовали трансгенные растения 40 различных видов, относящихся к разным семействам, включая злаки. После успешных экспериментов появились опасения о возможном вреде генетической инженерии для природы и человечества. Однако уже более чем за четверть века своего существования генетическая инженерия не принесла ущерба ни природе, ни человеку. Главное, в любых экспериментах по генной инженерии следует соблюдать разработанные правила.

Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства, так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая. В арсенале генной инженерии растений есть много приемов, позволяющих получить трансгенные растения, устойчивые к насекомым. Традиционно используют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсин Bacillus thuringiensis. Эта тюрингская бактерия продуцирует крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt, который, попадая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к их гибели. На приведена схема конструирования вектора и получения трансгенных растений хлопка, которые приобретают признак устойчивости к насекомым. В настоящее время уже синтезирован искусственный ген bt, конструкция с которым более эффективна, а сами трансгенные растения обладают широким спектром устойчивости к насекомым. Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами "Monsanto", "Ciba Seeds" и продаются на рынках мира, хотя дискуссии об их использовании еще не закончены.

Известно, что растения, так же как и животные, способны вырабатывать иммунитет. Этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения, у которых при атаке патогенов сильно меняется метаболизм.
Например, у устойчивых растений накапливаются такие химические соединения, как перекись водорода (Н2О2), салициловая кислота (SA), фитоалексины
(соединения, выполняющие защитную функцию в растении). Повышенное содержание этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами. Вот один из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений. Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы (этот фермент разрушает SA), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно- инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген H2O2 может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с "antisense RNA" (перевернутой или антисмысловой
РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180?. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется. Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы (polygalacturonase) - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE
(ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен - это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.

Таким образом, стратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений.

Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях - для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt и т.д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений.

В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему
"лишних косточек", например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

Остается добавить несколько слов еще об одном аспекте возможностей использования Ti-плазмиды агробактерии. Обезоруженную, лишенную онкогенов
Ti-плазмиду ученые активно используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерционного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты. Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу обнаружить и клонировать соответствующий ген. В настоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены клонированы. В нашей лаборатории М.А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу.

Областей применения трансгенных растений так много, что все имеющиеся сведения невозможно изложить в рамках одной статьи. На уровне лабораторных экспериментов ведутся работы по получению растений, устойчивых к холоду, тяжелым металлам, повышенному содержанию солей и др. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам (химическим соединениям, которые используют для борьбы с сорняками), к вирусам, растения с повышенным содержанием масел и незаменимых аминокислот уже выращивают на миллионах гектаров. Не менее интересен и другой аспект работ - получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров - это получение растений петунии с разноцветными цветками. На очереди голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.

Итак, многие надежды уже сейчас превратились в свершения, а агробактерия с ее удивительной Ti-плазмидой в руках ученых стала настоящим инструментом как для познания функционирования растительного генома, так и для решения многих проблем, которые стоят перед сельским хозяйством. К сожалению, в нашей стране трансгенные растения еще остаются на уровне лабораторных экспериментов, поскольку дорога от лаборатории до поля, как и много лет назад, остается непротоптанной, а во многих лабораториях, в том числе и в нашей, уже есть трансгенные растения, которые ждут своего часа.

2. Онкогенез, вызываемый у животных ДНК-вирусами.

Исследования канцерогенеза у животных нередко проводятся на культурах тканей. Если перенести клетки животных, например из органов кур или хомячков, или фибробласты человека в подходящую питательную среду, то на внутренней стенке культурального сосуда они начнут размножаться. Обычно клетки продолжают расти лишь до тех пор, пока не начнут соприкасаться между собой. Из-за контактного торможения образуется только однослойный клеточный газон. Если же эти нормальные клетки инфицировать опухолеродным вирусом, то контактное торможение снимается, клетки продолжают размножаться и начинают надвигаться друг на друга. Многослойный рост наблюдается только у клеток, претерпевших опухолевую трансформацию. Из клеточной массы легко выделить отдельные клетки и таким путем получить чистые линии (клоны) трансформированных клеток.

Вирусы полиомы и SV40 ("Обезьяний вирус 40") относятся к группе паповирусов. Они содержат двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. В эксперименте вирус можно перенести для размножения в клетки тканевой культуры. Размножаясь в некоторых (так называемых пермиссивных) клетках, вирус вызывает их лизис, и по мере его размножения клетки гибнут. В других
(непермессивных) клетках вирус ведет себя иначе. В этом случае размножение вируса подавляется, и примерно в одной из 105 клеток вирусная ДНК интегрируется в клеточную ДНК. Такое включение вирусной ДНК в геном клетки- хозяина может приводить к опухолевой трансформации. В трансформированной клетке образуется белок (Т-антиген), который запускается репликацию клеточной ДНК, и в результате начинается размножение клеток. Инъекция такого рода трансформированных клеток животым приводит к быстрому образованию опухолей.

Онкогенез, вызываемый у животных РНК-вирусами.

К образованию опухолей у животных могут быть причастны также и РНК- вирусы – ретровирусы. Они относятся к икосаэдрическим вирусам с оболочкой и содержат (+)РНК-геном (одноцепочечную РНК). В качестве онкогенных вирусов они, например, вызывают саркому Рауса и кур и лейкемию у мышей. Название
"ретровирусы" связано с тем, что в их размножении участвует обратная транскриптаза. РНК этих вирусов не может воспроизводиться путем простой репликации – необходима ее предварительная транскрипция в ДНК с последующей интеграцией этой ДНК в одну их хромосом клетки-хозяина. Интеграция – необходимый этап репродукции вируса; только интегрированная вирусная ДНК будет транскрибироваться. Так как интеграция в клеточную ДНК входит в жизненный цикл вируса, частота интеграции очень велика. Вероятно, вирусная
ДНК может включаться в клеточную в любом месте.

Размножение вируса не приводит к лизису клетки. Нуклеокапсид образуется внтури клетки, перемещается затем к плазматической мембране и выходит наружу, одетый в оболочку из этой мембраны. Интегрированная ДНК ретровируса реплицируется вместе с геномом клетки-хозяина и поэтому содержится в каждой клетке опухоли (саркомы). Опухолевый рост клеток обусловлен экспрессией вирусного гена "src". Этот ген кодирует белок, который по-видимому, представляет собой киназу, фосфорилирующую белки. Можно думать, что эта киназа участвует в преобразовании дифференцированной клетки в клетку эмбрионального типа.

Недавно была выяснена последовательность оснований в вирусной РНК.
Оказалось, что она сходна в последовательностью одного из генов человека.
Отсюда можно заключить, что src – это ген животного происхождения, который в результате неточной транскрипции был включен в РНК вируса вместе с вирусными генами и закрепился в ней. Это мог быть ген, кодирующий важный для эмбриональной клетки фактор роста. Таким образом, опухоли, вызываемые ретровирусами, в конечном счете обусловлены переносом какого-то гена животного происхождения в клетку животного.

"Рак вызывается вирусами". Это некогда сумасшедшая идея Л. А. Зильбера высказанна еще в середине 30-х годов. То, что вирусы могут вызывать опухоли у мышей, у крыс, у кур - доказано. Но при чем тут человек? Загадка происхождения рака волновала ученых с тех пор, как медики научились распознавать это страшное заболевание. Что вызывает злокачественное перерождение клеток, стремительный лавинообразный их рост, когда, вторгаясь в здоровые ткани и органы, они душат, опутывают, убивают все живое?В начале нашего века выяснилось, что рак может возникнуть под влиянием разных химических веществ, их стали называть канцерогенами. Ртуть и мышьяк, дым сигареты и анилиновые красители, каменноугольная смола и минеральные масла, типографская краска и асбест... Подчас кажется, что лишь горстке из нас каким-то чудом удается выжить в этом канцерогенном океане.

Итак, ливень, поток, потоп канцерогенов. А может быть, и генетический рок: есть люди, которым предопределено заболеть раком, это заложено в них наследственно, генетически?

Ушел в историю XIX век с его блестящими открытиями в микробиологии, закончился и ХХ, вместе со вторым тысячелетием, с лавиной открытий во всех областях науки и техники. Однако воз и ныне там. До сих пор о причинах развития рака (по научному - этиологии), до сих пор ничего не известно.
Конечно, мы знаем, что может служить фактором риска, но почему и у кого завтра разовьется опухоль - никто сказать, к сожалению, пока не может.
Человек нашел возбудителей многих страшных болезней. Еще в конце ХIX века
Д. И. Ивановский открыл мир вирусов, а в самом начале XX века один из первых вирусологов Европы А. Боррель впервые в печати высказал гипотезу: а не фильтрующиеся ли вирусы вызывают злокачественные опухоли?

Вскоре В. Эллерман и О. Банг сообщают, что лейкозы у кур действительно могут иметь вирусное происхождение. И готовы экспериментально подтвердить это... Впрочем, тогда лейкозы не причисляли еще к злокачественным новообразованиям, так что вопрос вроде бы совершенно неясен. Неясен для всех, кроме... И. И. Мечникова. Еще в 1910 году этот великий провидец науки печатает в газете "Русское слово" статью, в которой пишет буквально следующее: "Одна причина рака, безусловно, находится в самом организме, но другая попадает в него в виде экзогенного начала, скорее всего - вируса".

Проходит всего только один год, и ветеринарный врач П. Раус представляет доказательства вирусной природы плотной (иначе, солидной) опухоли кур, так называемой саркомы Рауса. Это открытие было сделано в 1911 году, а Нобелевская премия за него была присуждена Раусу через... полвека.
Счастье, что он успел дожить до своего триумфа!

Между открытием и его признанием (и использованием) весьма часто лежат
"дистанции огромного размера". Вспомним, что законы Г. Менделя были совершенно не оценены современниками и по существу переоткрыты заново через
50 лет, когда их творца уже не было в живых. Вирус полиомиелита открыл К.
Ландштейнер в Вене в 1909 году, а эффективная вакцина против этого страшного заболевания появилась на свет только в 50-е годы. Вирус гриппа впервые выделен от человека К. Эндрюсом в 1933 году, эффективных гриппозных вакцин нет до сих пор, а уж Нобелевской премией за решение проблемы гриппа, как говорится, и не пахнет. Так что Раус - счастливый человек!

Впрочем, вернемся в начало ХХ века. Мелькнувшая в те годы в работах А.
Борреля, И. И. Мечникова, В. Эллермана, О. Банга, П. Рауса мысль о вирусной природе рака, мысль, в значительной мере подсказанная охотой за вирусами, погасла на целую четверть века.

В самом деле, были открыты болезнетворные вирусы, вызывающие оспу, корь, грипп, свинку, желтую лихорадку, но где он, вирус рака человека, и если он есть, почему его никто и никогда не смог настигнуть и увидеть?

...14 декабря