Изменения окислительно-восстановительного потенциала среды культивирования устойчивой к тяжелым металлам бактерии Pseudomonas diminuta: взаимосвязь с выделением из клеток металлотионеинподобных белков

Особое положение тяжелых металлов (ТМ) среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления организмами и передачи по пищевым цепям, так и с высокой токсичностью (Reddy, Prasad, 1990). Воздействие ТМ прежде всего сказывается на первичных продуцентах - микроводорослях и цианобактериях, которые наравне с гетеротрофными микроорганизмами могут использоваться для детоксикации и извлечения ценных металлов, поскольку способны аккумулировать их из водной среды и донных отложений в количестве, многократно превышающем потребность в них, как в компонентах минерального питания (Nagase et al., 1994). Наибольшей устойчивостью к ТМ отличаются микроорганизмы, выделенные в местах, содержащих промышленные загрязнения, либо месторождения соответствующего металла (Горленко и др., 1977).

Ванадий, как один из широко распространенных ТМ, используется зелеными, желто-зелеными и бурыми водорослями, содержится в альтернативных нитрогеназах некоторых почвенных бактерий, но не является необходимым элементом для развития большинства прокариотных микроорганизмов, среди которых наиболее активными биоаккумуляторами ванадия являются бактерии рода Pseudomonas, а также ряд цианобактерий (Rehder, 1991). Его токсический эффект обусловлен главным образом тем, что восстанавливаясь в клетках, он стимулирует образование свободнорадикальных состояний О2 (Popper et al., 1991).

Ионы ТМ образуют меркаптиды с SH-группами тиоловых соединений клеток: реакция обратима, но равновесие ее смещено в сторону слабодиссоциирующих металлтиолатов (Торчинский, 1977). Устойчивость фототрофных и других микроорганизмов к действию ТМ в наибольшей степени обусловлена специфическим связыванием основной части поглощенных клетками ТМ смежными остатками цистеина в молекуле специализированных белков - металлотионеинов (МТ). Общим для этих белков является молекулярная масса до 10 кДа и высокое содержание тиоловых групп. В спектре оптического поглощения МТ в УФ-области около 250 нм, наблюдаются типичные для металлтиолатных комплексов шиpокие полосы, которые исчезают пpи удалении металла (Ang, Wong, 1992). Цианобактерии, культивируемые в присутствии высоких концентраций ванадата синтезируют связывающий ионы металла МТ второго класса (Саванина и др., 1995).

В настоящей работе установлена корреляция между зависимым от ванадата накоплением в среде культивирования бактерий Ps. diminuta низкомолекулярных, богатых SH-группами белков и изменениями окислительно-восстановительного потенциала (Eh) среды.

Материалы и методы

В работе использовали гетеротрофные бактерии, выделенные из придонного осадка ванадийсодержащего промышленного водоема и идентифицированные нами как Ps. diminuta (Саванина и др., 1998). Бактерии культивировали при температуре 25-27° в конических колбах на среде, содержащей в 100 мл водопроводной воды глюкозу и пептон в концентрации по 1 г/л (pH 7,2).

Для определения в культуральной жидкости Ps. diminuta содержания низкомолекулярных белков и SH-групп пробы диализовали 24 час при 0о против 50 мМ Трис-HCl буфера, pH 7,6, включающего 10 мМ ЭДТА с использованием мембраны фирмы Serva (Германия) с диаметром пор, пропускающих молекулы массой <10-15 кД. В присутствии ЭДТА, сульфгидрильные группы МТ и других SH-содержащих соединений освобождаются от большей части связанного ванадия и становятся реакционноспособными.

Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически при 540 нм на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония), модель U-2000. Для определения концентрации ванадия в биологическом материале и культуральной жидкости использовали цветную реакцию ванадия с 4-(2-пиридилазо)-резорцином. Клетки предварительно трижды отмывали от среды культивирования и озоляли азотной кислотой. Оптическую плотность измеряли на том же спектрофотометре при 520 нм используя коэффициент молярной экстинкции 24500М-1см-1. Содержание диализованных низкомолекулярных белков определяли по Лоури (Lowry et al., 1951). Концентрацию тиоловых групп в этих белках и других соединениях определяли с реактивом Элмана (5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) кислота) в присутствии ЭДТА (Веревкина и др., 1977) и регистрировали при длине волны 412 нм на том же спектрофотометре используя коэффициент молярной экстикции 11400М-1см-1. Величины pH и Eh среды култивирования измеряли на электрометре фирмы Cole-Parmer (США), модель DigipHase, pH определяли с помощью комбинированного стеклянного электрода с двойным Ag/AgCl электродом сравнения фирмы Radiometer (Голландия); для определения Eh использовали Pt-электрод, а в качестве электрода сравнения - Ag/AgCl (оба электрода Российского производства); потенциал электрода сравнения относительно нормального водородного электрода, измеренный как в работе (Barsky, Samuilov, 1979), составляет 225±10 мВ. Таким образом, истинная величина Eh среды представляет собой сумму измеряемой величины Eh и потенциала электрода сравнения.

Рис. 1. Эффект ванадата на рост культуры Ps. diminuta; 1 - контроль; 2, 3 - в присутствии 100 и 700 мг/л ванадата соответственно.

Результаты и их обсуждение

Клетки Ps. diminuta, изолированные из пробы придонного осадка промышленного водоема, сбросовые воды которого содержат как отходы металлургического производства ванадий в концентрации 100-700 мг/л, хорошо растут как без ванадата, так и в его присутствии; при этом максимальное количество клеток бактерий достигает 2x107 кл/мл среды через 12-16 суток культивирования (рис. 1). Ванадат в концентрации 700 мг/л снижает накопление биомассы Ps. diminuta на 30-40%. В дальнейших опытах ванадат добавляли в концентрации 100 мг/л, поскольку не оказывая заметного влияния на рост бактерий, ванадат в этой концентрации значительно стимулировал выделение из клеток низкомолекулярных белков.

Применение метода диализного (смешанно-раздельного) культивирования фототрофных микроорганизмов - цианобактерий или микроводорослей с гетеротрофными бактериями рода Pseudomonas (Гусев и др., 1988) позволило выявить ряд закономерностей роста двух различных культур, разделенных полупроницаемой мембраной. При культивировании фототрофного компонента в присутствии ванадата клетки активно выделяют в среду углеводы и гликолат. Эти соединения используются для роста гетеротрофным компонентом в качестве субстратов окисления. При этом бактерии эффективно поглощают ванадат, существенно снижая его концентрацию в среде (Саванина и др., 1994; Гусев и др., 1997).

Рис. 2. Содержание ванадата в клетках (1) и в среде (2) в зависимости от возраста культуры Ps. diminuta.

Действительно, как показывают наши опыты содержание ванадата в клетках Ps. diminuta, в течение первых 2 суток культивирования быстро увеличивается от 0 до 5-6 мкг/млн клеток, а затем снижается приблизительно в 10 раз (рис. 2, кривая 1). Иная картина наблюдается относительно концентрации ванадата в культуральной жидкости. За первые двое суток культивирования Ps. diminuta содержание ванадата в среде падает от 100 до 10-12 мг/л, а затем начинает постепенно увеличиваться по мере развития культуры; причем в среду возвращается до 60% ванадата (рис. 2, кривая 2). Как видно, накопление ионов ванадия в клетках коррелирует c его содержанием в культуральной жидкости: увеличение концентрации ванадата в клетках сопровождается ее снижением в среде культивирования и наоборот.

Столь значительное увеличение концентрации ванадата в среде по мере выхода кривой роста на стационарный уровень может быть обусловлено тем, что ванадат выделяется из нативных и разрушенных клеток вместе с компонентами связывающими металл. Такими компонентами прежде всего являются низкомолекулярные богатые SH-группами белки; могут быть и другие тиоловые соединения, к которым относятся глутатион, цистеин, тиогликолевая кислота, дитиоэтанол, дитиопропанол и т.д.

Известно, что специфическую устойчивость фототрофных микроорганизмов к действию ТМ обеспечивает наличие в клетках SH-содержащих белков с мол. м. до 10 кДа, связывающих большую часть поглощенных клетками ТМ (Obata et al., 1994). Содержание низкомолекулярных белков и коррелирующее с ним содержание SH-групп в клетках цианобактерий возрастает под действием ванадата (Лебедева и др., 1993). Выделенный из клеток Anacystis nidulans белок был идентифицирован как МТ II класса, связывающий ванадий (Саванина и др., 1995). Известно, что МТ большинства прокариот как правило состоят из одной полипептидной цепи с мол. м. до 7-10 кДа и высоким содержанием цистеина (в среднем до 30%) (Kagi, 1993). Клетки Ps. fluorescens выделяют в среду связывающие ионы Zn полипептиды с мол. м. 1-3,5 кДа. (Appana, Whitmore, 1995). Поскольку клетки Ps. diminuta выделены из ванадийсодержащего промышленного водоема и по данным рис. 1 устойчивы к действию ванадата, представляет интерес определение содержания низкомолекулярных белков и SH-групп в культуральной жидкости Ps. diminuta в динамике развития культуры.

Рис. 3. Зависимость содержания низкомолекулярных белков (1, 2) и SH-групп (3, 4) в среде от возраста культуры Ps. diminuta. 1, 3 - контроль; 2, 4 - в присутствии 100 мг/л ванадата.

Как видно из рис. 3 в среде культивирования Ps. diminuta наблюдается накопление низкомолекулярных белков, содержание которых к 12 суткам составляет около 50 мкг/мл (кривая 1). В присутствии ванадата количество белка к этому периоду времени возрастает до 450 мкг/мл (кривая 2). Это согласуется с ранее полученными данными о стимуляции синтеза МТ у цианобактерий (Лебедева и др., 1993; Саванина и др., 1995) и в клетках животных организмов (Gachot et al., 1994).

Подобным образом ванадат стимулирует накопление SH-групп низкомолекулярных белков и, возможно, других тиолсодержащих соединений в среде культивирования Ps. diminuta (рис. 3, кривые 3 и 4); зависимости содержания SH-групп в среде от возраста культуры имеют колоколообразный характер с максимумом, приходящимся на 8-9 сутки. Кажущееся несоответствие характеров накопления SH-групп и белка в среде (наличие спада в содержании SH-групп, тогда как по белку такого спада нет), может быть обусловлено окислением SH-групп кислородом, которое должно значительно усиливаться при значениях pH выше 7, как это показано ранее для цистеина (Barsky et al., 1984). Действительно, в соответствии с нашими данными pH культуры Ps. diminuta с возрастом увеличивается от 7 до 8,5; в присутствии ванадата величины pH на 0,3-0,5 единицы выше, чем в контроле.

Рис. 4. Изменения величины Eh среды в динамике развития культуры Ps. diminuta. 1 - контроль; 2 - в присутствии 100 мг/л ванадата.

Колоколообразная зависимость накопления SH-групп в среде от возраста культуры Ps. diminuta сопровождается сходной зависимостью снижения Eh среды. По мере развития культуры величина Eh уменьшается и достигает минимума (180-200 мВ) к 6-8 суткам, а затем вновь возрастает (рис. 4, кривая 1). В присутствии ванадата минимальное значение Eh достигает 80 - 90 мВ (кривая 2). Столь низкие значения Eh в аэробных условиях могут быть обусловлены только наличием в среде значительных количеств тиолсодержащих соединений, стандартный редокс-потенциал которых в анаэробных условиях существенно ниже 0 мВ. Так, например, 1,4-дитиотреитол, эффективно восстанавливающий SH-группы ферментов и кофакторов, имеет стандартный потенциал -330 мВ при pH7; сходными окислительно-восстановительными свойствами обладают тиогликолевая кислота, 2-меркаптоэтанол, димеркаптопропанол и др. (Досон и др., 1991).

В отличие от тиолов такие соединения, как органические кислоты, имеют стандартные редокс-потенциалы в интервале от 50 до 250 мВ. Согласно нашим данным (рис. 5) для достижения величины Eh около 200 мВ содержание аскорбата в среде в аэробных условиях должно составлять несколько мМ (кривая 2), а в случае гликолата его концентрация при Eh около 300 мВ достигает 200-400 мМ (кривая 3).

Рис. 5. Зависимость величины Eh от концентрации SH-групп цистеина, инкубируемого в 20 мМ буфере морфолинопропансульфонате (pH 7,0).

На рис. 5 также показана зависимость величины Eh буферного раствора от концентрации SH-групп цистеина (кривая 1). Видно, что величинам Eh около 200 и 100 мВ соответствуют концентрации SH-групп около 20 и 120 мкМ. Эти значения согласуются с величинами Eh (рис. 4) и концентрациями SH-групп (рис. 3) в культуральной жидкости Ps. diminuta.

Таким образом, полученная корреляции между содержанием ванадата в клетках и культуральной жидкости Ps. diminuta, накоплением низкомолекулярных белков и SH-групп и изменениями Eh среды культивирования бактерий позволяют полагать, что ионы ванадия, поглощенные клетками Ps. diminuta стимулируют образование тионеинподобных белков, связываются с ними с участием SH-групп и выделяются из клеток вместе с белками, продуктами их деградации или с другими тиоловыми соединениями.

Список литературы Веревкина И.В., Точилкин А.И., Попова Н.А. 1977. Современные методы в биохимии, М. Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов С.И. 1977. Экология водных микроорганизмов, М. Гусев М.В., Вольберг М.М., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б. 1988. Использование метода диализного культивирования для подбора симбиотических альгобактериальных пар//Биол. науки, № 1, 103-106. Гусев М.В., Лебедева А.Ф., Саванина Я.В., Барский Е.Л. 1997. Устойчивость культур цианобактерии Anacystis nidulans и микроводоросли Dunaliella maritima к токсическому действию ванадия: влияние фосфата, железа и цистеина//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 3, 12-17. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. 1991. Справочник биохимика, М. Лебедева А.Ф., Саванина Я.В., Савельев И.Б. 1993. Распрeделение ванадия в клетках цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum: взаимосвязь с SH-содержащими низкомолекулярными белками//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 4, 58-61. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б. 1994. Смешанно-раздельное культивирование цианобактерий Anacystis nidulans и Nostoc muscorum и бактерий рода Pseudomonas в присутствии ванадия//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 2, 29-34. Саванина Я.В., Адани А.Г., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б., Гусев М.В. 1995. Образование ванадий-тионеина клетками Anacystis nidulans при высоких концентрациях металла//Вестн. МГУ. Сер. Биология, № 1, 38-46. Саванина Я.В., Пахомкина Б.С., Лебедева А.Ф., Дольникова Г.А. 1998. Смешанно-раздельное культивирование цианобактерий Anacystis nidulans, Anabaena variabilis и Nostoc muscorum с бактериями, выделенными из ванадийсодержащего промышленного водоема. Тез. докл. на V Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии" Гурзуф. Торчинский Ю.М. 1977. Сера в белках, М. Ang S.G., Wong V.W. 1992. Chromatographic analysis of low-molecularmass copper-binding ligands from the crab-spesies Scylla serrata and Portunus pelagicus//J. Chromatogr., 599, № 1-2, 21-24. Appana V.D., Whitmore L. 1995. Biotransformation of zinc by Pseudomonas fluorescens//Microbios., 82, № 332, 149-155. Barsky E.L., Samuilov V.D. 1979. Blue and red shifts of bacteriochlorophyll absorption band around 880 nm in Rhodospirillum rubrum//Biochim. Biophys. Acta, 548, 448-457. Barsky E.L., Kamilova F.D., Samuillov V.D. 1985. Do cyanobacteria contain a membrane bound cysteine oxidase?//Z. Naturforsch, 40 c, 176-178. Gachot B., Tauc M., Wanstoc F., Morat L., Poujeol Ph. 1994. Zinc transport and metallothionein induction in primary cultures of rabbit kidney proximal cells//Biochem. Biophys. Acta, 1191, № 2, 291-298. Kagi J.N.R. 1993. Purification and primary structure of snail metallothionein. Similarity of the N-terminal sequence with histones H4 and H2A//Eur. J. Biochem., 216, № 3, 739-746. Lowry O., Rosenbourg R., Farr A., Randal R. 1951. Protein measurement with Folin phenol reagent//J. Biol. Chem., 193, 265-275. Nagase H., Inthorn D., Miuamoto K. 1994. Use of photosynthetical organisms in biological purification//Jap. J. Toxicol. and Environ. Health, 40, № 6, 479-485. Obata H., Inoue N., Imai K., Umebauashi M. 1994. Cadmium tolerance of calli induced from roots of plants with differences in cadmium tolerance//Soil. Sci. and Plant. Nutr., 40, № 3, 351-354. Popper H.H., Woldrich A., Grigar E. 1991. Comparison of chromate and vanadate toxicity and its relationship to oxigen radical formation//Zentralb. Hyg. und Umweltmed, 194, № 4, 373-379. Reddy G.N., Prasad M.N.V. 1990. Heavy metal binding proteine. Polypeptide: occurence, structure, synthesis and function//Environ. Exp. Bot. 30, N 3. 251-264 Rehder D. 1991. Bioorganisme Chemie des Vanadiums//Angev. Chem., 103, № 2, 152-172.