Избирательное повреждение интерстициальных клеток Кэйждела (ИКК) метиленовым синим и светом ведёт к потере медленных волн.
Инкубация в 50 ммоль метиленового синего (МС) и последующая интенсивная иллюминация приводит к исчезновению активности медленных волн в ИКК подмышечного слоя циркулярных мышц в препаратах толстого кишечника собак. Это часто сопровождается снижением потенциала покоя мембран. Реполяризация клетки к исходным –70мВ не восстанавливает активность медленных волн, что указывает на то, что МС непосредственно прерывает образование медленных волн. После инкубации МС, 2-х минутная иллюминация изменяет конформацию митохондрий в ИКК от очень конденсированной до ортодоксальной, без индуцирования каких-либо других видимых изменений в гладкомышечных клетках. После 4-10 минутной иллюминации, ИКК начинают прогредиентно разрушаться увеличенными и разорванными митохондриями, теряют цитоплазматическую контрастность и детальность, появляются разрывы плазматических мембран. В то же время не выявляются повреждения в гладкомышечных и нервных клетках. Ультраструктура соединительных щелей сохраняется. Интенсивная иллюминация без преинкубации МС приводит к утрате медленных волн, при этом не нарушается ультраструктура в препаратах ИКК. В препаратах гладких мышц, без подмышечного слоя ИКК, МС и свет не изменяют электрической активности. Авторы считают, что корреляция между избирательным повреждением подмышечных ИКК и избирательной утратой активности медленных волн указывает на то, что ИКК играют незаменимую роль в генерации медленных волн.
Концепция регуляторной роли интерстициальных клеток Кэйджела в функционировании желудочнокишечного тракта (ЖКТ) впервые была выдвинута Stach в 1972 (30), Duchon et al. В 1974 (6), и Faussone-Pellegrini в 1977 (9). И только в 1982 году была выдвинута гипотеза – ИКК играют роль в генерации ауторитмичности ЖКТ (Thunberg). Очевидность того, что ИКК способствуют генерации активности синусового узла и последующей генерации медленных волн было установлено на ряде тканей, включая тонкий кишечник и толстый кишечник. Важно и то, что ИКК обнаруживаются в тех областях (подмышечные сплетения толстого кишечника), где образуются медленные волны.
В толстом кишечнике собак, очевидность роли ИКК в генерации активности синусового узла вытекает из следующего:
1. Когда сети ИКК удаляются, слой циркулярных мышц (ЦМ) не может генерировать активность медленных волн
2. В очень тонких препаратах, состоящих из сети ИКК и связанных с ними гладкомышечных клеток, постоянно записываются спонтанные медленные волны.
Авторы показали, что электрическая активность записанная на поверхности подмышечного слоя – следствие электрического взаимодействия между телом ЦМ и подмышечной сетью ИКК вместе с гладкомышечными клетками (ГМК). В результате излишних пар ИКК к ГМК с помощью соединительных щелей, роль каждого типа клеток в генерации медленных волн не может быть определена точно в электрофизиологических исследованиях с применением изолированных мышечных лоскутов.
До появления электронной микроскопии, большинство селективных методов для распознования ИКК основывались на способности последних аккумулировать краситель МС вне физиологических условий. Взависимости от условий МС может первично связываться ИКК или нервной тканью. В пршлом идентификация ИКК с использованием прижизненного окрашивания МС применялась только на тонком кишечнике мышей, гвинейских свиней и кроликов. В свежих публикациях, авторы демонстрируют способность аккумуляции ИКК толстого кишечника собак. В том же исследовании, авторы показали, что в подавленном свете МС не вызывает изменений ультраструктур в окрашенных ИКК и знчительно не изменяет медленных волн.
В предварительном исследовании, авторы выяснили, что активность медленных волн тонкого кишечника мышей исчезает , когда селективно окрашенные ИКК освещаются. Более того, иллюминация МС-окрашенных ИКК в культурируемых кусочках тонкого кишечника мышей приводила к потере спонтанной ритмичной контрактильной активности, это эффект был обратимым на короткий период при иллюминации низкой интенсивности, но необратимым в других случаях.
Задачей авторов было обнаружить метод специфического повреждения ИКК толстого кишечника собак. Фототоксические свойства МС использовались для изучения вероятных эффектов на активность медленных волн и изменения ультраструктуры различных типов клеток связанных с подмышечной сетью ИКК.
МЕТОДЫ.
Ткани и препараты.
Собаки обоих полов были убиты передозировкой калиевой соли фенобарбитала (100 мг/кг). Примерно 5 см проксимального отдела толстой кишки было взято от каждой собаки, отступя 5 см дистальнее от илеоцекального сочленения. Затем толстый кишечник вскрывался продольным разрезом. Затем очищенный сегмент прикреплялся ко дну диссекционной чаши Сильгарда наполненной постоянно оксигенированным (95% кислорода и 5% СО2) раствором Кребса.
Чтобы изучить специфичность действия МС и света, авторы исследовали действия МС и света и на препаратах ИКК-ЦМ (подмышечная сеть ИКК и ЦК) и на препаратах ЦМ (ЦМ, отделённые от подмышечного слоя ИКК и гладкомышечных клеток.
Примерно 2 кв. мм. Ткани, с подмышечной поверхностью, обращённой вверх прикреплялся ко дну переносного держатель. Затем ткан была разрезана вдоль прикреплённых краёв, исключая один край, где была вырезана полоса длиной 10 мм, шириной 3 мм вдоль длинной оси ЦМ клеток. Свободный конец полосы был взят на хирургический шёлк (0,5 мм в диам). Держатель перемещали в разделённую камеру причём прикреплённую ткань – в записывающую камеру, свободный конец в стимулирующую камеру. Свободный конец также соединяли с сильным преобразователем.
Лекарства и растворы.
Все растворы вводимы в раздельную камеру были нагреты до 37 гр и оксигенированы кислородом 95% - СО205%. Состав раствора Кребса был такой: 120,3 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 20,2 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4 и 11,5 глюкозы. МС (сигма) был расстворён в растворе Кребса.
Внутриклеточные записи.
Внутриклеточные записи были сделаны микроэлектродами имевшими пиковое сопротивление 30-50 ом. Микроэлектроды были заполнены 3 М KCl. Заполненные микроэлектроды подключались к держателю соединённому с электрометром. Данные электрометра отражались на осцилоскопе и записывались на принтер. Электрические импульсы подавались на мышечный лоскут. Сила электрического поля отражалась на осцилоскопе и записывалась на принтере. Мышечные лоскуты подлежащие воздействию импульсами продолжительно оксигенировались раствором Кребса с частотой 500 мл/час в разделительной камере как минимум 2 часа при температуре 37 град перед началом эксперимента.
Во время инкубации МС (50 ммоль) интенсивность света была низкой. Затем препараты мылись раствором Кребса примерно 5 минут. Препараты иллюминировались оптическими волоконными лампами (максимальная интенсивность составила 50 мВ/кв.см. поверхности ткани удалённой от источника света на 3,5 см). интенсивность света измерялась цифровым фотометром. После эксперимента лоскуты немедленно помещали в формалин.
Световая и электронная микроскопия.
После экспериментальной процедуры Сильгард отделяли отдержателя с тканью, фиксированной формалином. Лоскуты хранились при температуре 4 град. Каждый лоскут делили на 4-6 кусочков ткани. Перед дальнейшей процедурой степень связывания МС определялась стереомикроскопией. Затем ткань мылась 0,1 м фосфатным буфером, фиксировалась 2% осмической кислотой в 0,1 М фосфатном буфере в течении 1 часа. Ультратонкие образцы фиксировались спиртовым ацетатом мочевой кислоты и исследовались в электронном микроскопе.
Статистический анализ.
Статистическая значимость данных внезависимости от различных условий была установлена Student’s тестом.
Результаты.
Электрофизиологические исследования.
Эффекты света на МС окрашенные ИКК-ЦМ препараты. Инкубация ИКК-ЦМ препаратов в 50 ммоль МС + 45 мин деполяризация клеток повышают продолжительность медленных волн. Чтобы уменьшить неспецифические экстрацеллюларные эффекты МС вовремя иллюминации, ткань мылась раствором Кребса. Во время этого устранялись эффекты МС на активность медленных волн. Эта часть эксперимента выполнялась в подавленном свете.
После инкубации в ИМС и мытья интенсивная иллюминация упраздняла активность в ИКК-ЦМ препаратах. Упразднение меделнных волн сопровождалась деполяризацией клеток к мембранному потенциалу –47 мВ (колебания от –64 мВ до –42мВ). Совместно этому исчезли фазовые сокращения и тонус лоскута повысился. Активность медленных волн не поражалась, когда ИКК-ЦМ препараты иллюминировались с максимальной интенсивностью в течениии 10 минут без предварительной инкубации в МС.
Упразднение медленных волн не было прямым эффектом деполяризации с того момента, как реполяризация не восстанавливала активность медленных волн, даже когда реполяризация применялась до того, как амплитуда медленных волн полностью уменьшалась. Эти наблюдения указывают на то, что эффекты МС и света на механизм генерации активности медленных волн не зависят от мембранного потенциала. В противоположность этому изменения активности медленных волн, вызванные повышением внеклеточной концентрации калия зависят исключительно от деполяризации, как только реполяризация мышечных лоскутов полностью обратит эффекты. Кроме этого, упразднение активности медленных волн может быть обнаружено при деполяризации лишь потенциалом 8-12 мВ (медленные волны упраздняются при величинах мембранных потенциалов –60,4 мВ) .
Скорость, с которой упразднялись медленные волны варьировала непосредственно с интенсивностью света. При иллюминации с максимальной интенсивностью, медленные волны исчезают в пределах 0,8-3 минут. Уменьшение интенсивности света повышает продолжительность промежутка исчезновения медленных волн до 3-12 минут.
Время необходимое для исчезновения медленных волн также зависит от длительности инкубации в МС. Когда препараты ИКК-ЦМ инкубировались в МС в течении 7 минут с последующим периодом прмывки 5 минут, иллюминация с максимальной интенсивностью устраняла медленные волны через 4-8 минут (n=5). Эффекты МС и света были необратимы.
Эффекты МС и света на ЦМ препараты: Специфичность действия МС изучалась с использованием ЦМ препаратов, которые не содержат подмышечной сети ИКК. Инкубация в МС в течении 45 минут не вызывала эффектов на электрических параметрах препаратов ЦМ, находящихся в покое (мембранный потенциал покоя=-62,8 мВ), так же не было эффектов при иллюминации с максимальной интенсивностью в течении 6 минут (n=4), что было вдвое больше максимального количества времени, требуемого для упразднения медленных волн в ИКК-ЦМ препаратах в тех же условиях.
Принимая во внимание тот факт, что способность препаратов ИКК-ЦМ к генерации медленных волн была избирательно устранена МС и светом, подобная активность ЦМ препаратов не была устранена. После обработки МС и светом и промывки раствором Кребса, добавление BaCl 2 (0,5 мМ) и BAY K 8644 (0,1 мМ) снижает мембранный потенциал покоя до –46,1 мВ и вызывает появление шипоподобых потенциалов с частотой, амплитудой и длительностью соответственно:18,7 циклов/мин; 16,5 мВ; 1,6 с. Частота потенциалов действия была снижена, когда клетки были реполяризованы потенциалом величиной 8-12 мВ и полностью упразднялась реполяризацией клеток к той же величине потенциала покоя каким он был в растворе Кребса. Эти наблюдения были типичны для ЦМ препаратов в присутствии BaCl2 и BAY K 8644.
Структурная корреляция.
Световая микроскопия. Инкубация в 50 ммоль МС в течении 7 минут не вызывала видимого впитывания красителя лоскутами (n=12), в то же время 45 минутная инкубация приводила к отчётливому окрашиванию всех лоскутов (n=1-). Эти образцы были отчётливы особенно в участках , где резидуальный подслизистый слой был очень тонким. В первых экспериментах авторы установили полную утрату окрашиваемых ИКК, когда внутрення поверхность ЦМ слоя была извлечена из препарата вместе с подслизистой соединительной тканью. Вот почему во всех экспериментах, субмукоза была отделена как можно полнее ножницами, с минимальным механическим растяжением.
После 45 минутной инкубации МС окрашивание было также обнаружено кроме ИКК и небольшого количества аксонов, в эритроцитах внутри капилляров и венул, в тучных клетках в субмукозе и в интерстиции ЦМ. Гладкомышечные клетки не окрашивались. В 1мм срезах ЦМ были контрастны во всех МС окрашенных лоскутов, что определялось недостаточным количеством клеток. Ткани хорошо сохранялись. ХотяИКК-ЦМ препараты, которые были преинкубированы МС в течении 7 минут не показали видимого окрашивания, контрастность подмышечного ИКК слоя уменьшалась после иллюминации с максимальныой интенсивностью в течении 4010 минут как было установлено в случае окрашивания толуидином синим. Эти наблюдения коррелировали с ультраструктурными изменениями.
Электронная микроскопия: Контрольные данные – иллюминация без МС никаких ультраструктурных изменений не было обнаружено в ИКК-ЦМ препаратах (n=11, 2-10 мин иллюминация), которые освещались в течении 10 минут с максимальной интенсивностью без инкубации в МС. Три типа клеток, интимно связанных щелевыми соединениями и промежеуточными контактами присутствовали вдоль всего внутреннего края препаратов. ИКК соединяются с тонкими ветвистыми гладкомышечными клетками (ВКМК), которые в свою очередь формируют щелевые контакты и межуточные соединения с глубоко лежащими крупными клетками ЦМ.
Взаимодействие между этими типами клеток было важным, так как авторы обнаружили, что окрашивание МС и заметное повреждение после инкубации в МС и иллюминации были ограничены для ИКК, более чем для ВГМК и типичных гладкомышечных клеток. Хотя индивидуальный профиль клеточных отростков часто было невозможно классифицировать, то три типа клеток могут быть классифицированы сравнением ядерных частиц клеток:
1. ИКК были высоко разветвлёнными клетками с 2 или 5 первичными отростками, профили клеток, которые включали ядро, в соновном также содержали начало 1 или 2 первичных отростков. Перинуклеарная цитоплазма между началом отростков была очень тонкой. В начале отростков перинуклеарная цитоплазма доминировала большой аккумуляцией митохондрий. Часть цитоплазмы была занята узлами филамент с малыми тельцами ассоциированными с цитоплазмой и мембраной. Когда последние сравнивались с расположением плотных телец в гладкомышечных клетках (ЦМ и ВГМК), оказалось, что в цитоплазме ИКК их мало. Разбросанные микротубулы всегда присутствовали в перинуклеарной цитоплазме. Обширный эндоплазматический ретикулум состоял из системы переплетающихся соединённых между собой цистерн, организованных частично между и вокруг митохондрий, частично соединённых с тонкими цистернами. Цистерны были преимущественно тонкого типа, с грубой частью, характеризуемой широко разбросанными рибосомами.
2. Выше перечисленные черты были типичны для ИКК, но не для ВГМК или ЦМ. В ВГМК и ЦМ митохондрий было меньше и они были беспорядочно разбросаны. Профили подобные тем, что изображены на фотографиях 5а и 6а были типичны в случае, если плотность митохондрий в ВГМК меньше соответствующей величины в ИКК. Перинуклеарная цитоплазма была заполнена плотно расположенными филаментами (тонкого, толстого и промежуточного типов) со схожей структурой плотных телец (ассоциированные с цитоплазмой и мембраной) в ВГМК и ЦМ. ВГМК может быть отличена от ЦМ размером (более тонкие области перинуклерных филамент и более тонкие отростки у ВГМК) и нерегулярным появлением ветвистости в ВГМК. Ядерная морфология была схожей в ИКК, ВГМК и ЦМ.
Хотя могут обнаруживаться некоторые вариации ультраструктур при осмотре полусерийных срезов, профили больших отростков трёх типов клеток в общем могут быть классифицированы по критериям перечисленным выше.
Ультраструктура после инкубации в МС.
Целостная структура клеток и субклеточные детали не поражались МС как указывалось прежде. После 7 минутной инкубации в МС, во всех 3 типах клеток не обнаруживалось каких-либо изменений. Единственным постоянным изменением, наблюдавшимся во всех препаратах был переход митохондрий от конденсированной (расширенные внутрикристовые пространства и плотный матрикс) к ортодоксальной конформации (узкие кристы и разреженный матрикс) в ИКК. В противоположность этому, у гладкомышечных клеток митохондрии находились в различной конформации до и после обработки МС и светом. Никаких доказательств в пользу конформации митохондрий в гладкомышечных клетках (ГКМ) получено не было.
После инкубации в МС иллюминация в течении 4 и 10 минут вызывала серьёзные повреждения в ИКК и малом количестве ГКМ разбросанных по краю подмышечного слоя. После 4 минутной иллюминации самыми выдающимися изменениями в ИКК были увеличение митохондрий и увеличение вакуолизации цитоплазмы (n=3). После 10 минут иллюминации (n=3, фотографии 6в) ИКК были увеличенными имели низкую контрастность цитоплазмы, отлично различимые митохондрии, несколько кавеол и отверстия в плзматических мембранах, что вероятно говорило о её разрыве. Идентификация ИКК была возможной благодаря сохранению базальной пластинки и совместно с чертами цитоплазмы (такими как число митохондрий) и сохранению взаимосвязей с глубоколежащими клетками.
ОБСУЖДЕНИЕ.
Избирательное повреждение толстокишечных ИКК метиленовым синим и светом.
Авторы установили строгую очевидность того, что подмышечные ИКК незаменимы в генерации потенциалов действия медленных волн в ЦМ толстого кишечника собак непосредственно показав связь между избирательным повреждением ИКК и исчезновением медленных волн при этом. В свежих исследованиях авторы показали, что ИКК в подмышечном сплетении избирательно аккумулируют МС и что МС не вызывает каких-либо микроскопически заметных изменений в любых типах клеток, кроме он не имеет значительного эффекта на активность медленных волн. В настоящем исследовании авторы показали, что интенсивная иллюминация после инкубации в МС приводит к специфическому повреждению ИКК подтверждаемому элетронной микроскопией. Более того, когда ЦМ препараты, у которых были удалены подмышечные ИКК-ГМ сети, были инкубированы в МС с последующей иллюминацией , спонтанная и индуцируема электрическая активность не затрагивалась. Эти наблюдения указывают на то,что эффекты МС и света на ИКК-ЦМ препараты были специфичны только для ИКК, не связанных с ГМК.
Хотя устранение активности медленных волн МС и светом сопровождалось деполяризацией, последняя не была ответственна за ингибирование активности медленных волн, с того момента, как реполяризация клеток к их прежнему потенциалу покоя не восстанавливала медленные волны. Кроме того, было замечено, что медленные волныустраняются в большом диапозоне величин мембранных потенциалов, включая мембранный потенциал покоя, свойственный циркулярным мышцам, что указывает на , что изменения активности медленных волн не вызваны изменениями величин мембранных потенциалов. В противоположность этому, строфантин также деполяризует мембраны и при этом устраняет активность медленных волн (1). Тем не менее, реполяризация мембран к изначальному потенциалу покоя полностью восстанавливает активность медленных волн. Это указывает на то, что в присутствии строфантина, ингибирование активностимедленных волн - непосредственный эффект деполяризации.
Локализация аккумуляции МС внутри ИКК очень специфична. Когда преципитация МС была проведена так, что удалось избежать перемещения и образования грубых преципитатов было обнаружено, что электронно-плотные депозиты присутствуют только в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и его нет в других цитоплазматичексих компонентах (35). Это может указывать на то, что МС входит в ЭР непосредственно путём проникновения через пгладкие цистерны. Тем не менее, остаётся неясным почему МС накапливается в ЭР ИКК, но при тех же обстоятельствах не входит в ЭР ГМК. В опытных условиях настоящего исследования, изменения в конформации митохондрий так же как активности медленных волн были обнаружены при минимальной инкубации МС в течении 7 минут и минимальной иллюминации в течении 2 минут, что наводит на мысль о том, что первичной причиной устранения медленных волн является повреждение митохондрий.
Фотодинамическое цитотоксическое действие МС было известно многие годы (2). Недавно изучалась цитотоксическая эффективность фотоинактивации МС-чувствительных клеток рака желчного пузыря (10), включая и сопровождающие её ультраструктурные изменения (39). После короткого периода иллюминации (5 минут), докладывалось, что ультраструктурные изменения были идентичны данным авторов (дизинтеграция митохондрий и ранние признаки повреждения плазматических мембран) , а высокая продолжительность иллюминации вела к разрыву мембран клеточной фрагментации. В исследования фотодинамического действия МС на ДНК (23) было показано, что обратимые предповреждения ДНК, вызванные МС в темноте становятся необратимыми когда к инкубации в МС присоединяется иллюминация. Вот и в этом исследовании электрофизиологические эжффекты и ультраструктурные эффекты МС и света также были необратимыми.
Роль ИКК в генерации медленных волн.
Настоящее исследование подкрепляет гипотезу о том, что ИКК незаменимы для генерации активности водителя ритма в кишечнике. В подобных исследованиях, использующих тонкий кишечние мышей иллюминация светом красного лазера устраняла внутриклеточно записанную активность медленных волн после инкубации в МС (36). Было показано, что активность медленных волн поражается в препаратах где ИКК окрашивались МС и не поражается, где ИКК не окрашивается. В другом исследовании (37), спонтанная сократительная активность медленных волн была сохранена, когда в культурируемых кусочках мускулатуры тонкого кишечника мышей окрашенные МС ИКК были просмотрены под микроскопом в очень тусклом свете, но эти кусочки быстро становились неподвижными при сильном освещении.
Настоящее исследованиеспецифически устанавливает решающую роль ИКК в генерации медленных волн в толстом кишечнике собак как показывалось прежде (12,18,19,21,29). Авторы выдвигают гипотезу о том, что циклическая внутриклеточная активность периодически активирует токи водителя ритма. В этом случае ИКК могут являться или биохимическими часами или одновременно биохимическими часами и ионными каналами, отвечающими за генерацию тока водителя ритма. Хотя спонтанные осциляции, записанные в изолированных ГМК (25) и клетках близких по описанию к ИКК (17,26), и устранялись блокаторами кальциевых каналов L-типа и следовательно не отражают медленные волны, как компонент водителя ритма, которые в принципе этими блокаторами не устраняются (14). Таким образом, спонтанно происходящие осциляции не имеют характеристик медленных волн.
Следующий вопрос касается роли ГМК в генерации медленных волн, как компонента водителя ритма. Ветвистые ГМК, которые интимно соединяютс с ИКК соединительными щелями представляют особый интерес. Если ИКК единственные клетки ответственные за генерацию токо водителя ритма, то величина тока, которую каждая ИКК должна генерировать, чтобы деполяризировать все соседствующие с ней клетки с высоким сопротивлением поверхности, должна быть огромной. Возможно и другое: ИКК – это биохимические часы и ИКК посылают внутриклеточные метаболиты через соединительные щели в интимно соединённые с ними ГМК. Благодаря такой метаболической связи (8) ассоциированные ГМК могут находиться в синхронии с ИКК, когда каналы водителя ритма и в ИКК и в ассоциированных с ними ГМК – активированы. Обоснование этой части гипотезы требует идентификации каналов водителя ритма и доказательства существования таких каналов в ИКК и ГМК. Интересен тот факт, что в присутствии тетраэтил аммония, BaCl2 и карбохола, изолированный слой ЦМ без подмышечной рабочей сети ИКК-ГМК генерирует потенциалы действия, которые идентичны по частоте с медленными волнами, но устраняются блокаторами кальциевых каналов L-типа (D-600) (18). Это и последующее исследование (20) показали, что ЦМ без подмышечной рабочей сети ИКК-ГМК может генерировать потенциалы с характеристиками подобными активности медленных волн.
Активность медленных волн также исчезает после обработки тканей Родалином 123 в полнослойных препаратах мышц (38). Родалин 123 – специфический маркёр митохондрий, и таким образом он не специфичен для ИКК, хотя ИКК особенно богаты митохондриями. После проникновения в митохондрии, Родалин 123 становится цитотоксичным благодаря разрушению АТФ (24). Следовательно, эффект Родолина 123 наводит на мысль о том, что активность медленных волн находится в строгой зависимости от внутриклеточного метаболизма. Это согласуется с наблюдениями о том, что активность медленных волн чувствительна к высоким температурам (1), блокируется ингибиторами метаболизма, такими как динитрофенол и карбонил цианид (H. Preiksaitis и J.D. Huizing, неопубликованные данные) и поражается при изменении конформации митохондрий (настоящее исследование). Это поддерживает гипотезу авторов о том, что компонент медленных волн водителя ритма образуется благодаря внутриклеточному метаболизму.
Таблицы, графики и изображения.
Таблица 1. Эффекты инкубации в 50 мМ метиленового синего (45 минут) на электрическую активность препаратов ИКК-ЦМ с или без иллюминации
Параметры В растворе Кребса +Метиленовый синий +Свет Мембранный потенциал покоя, мВ -72,8+-0,8 -70,6+-0,9 -47,3+-1,9 -69,7+-1,6 Частота, циклов/минуту 5,3+-0,2 5,0+-0,2 Продолжительность, с Амплитуда действия, мВ 3,8+-0,3 38,6+-1,4 4,9+-0,7 37,4+-1,5 Амплитуда плато, мВ 34,1+-1,3 33,2+-1,6 Частота колебаний, мВ/c 192,3+-23,8 169,4+-18,7График 1. Электрофизиологические эффекты иллюминации на окрашенные МС препараты ИКК-ЦМ.
А: МС (45 минутная инкубация) немного снижает мембранный потенциал покоя и увеличивает продолжительность медленных волн. Эти эффекты исчезают после промывки препаратов от МС в растворе Кребса в течении 5 минут. Препарты затем освещались с максимальной интенсивностью. В последующем, амплитуда медленных волн снижалась при этом мембранный потенциал покоя уменьшался до –44мВ. Реполяризация мембран не востанавливала активность медленных волн, что указывает на то, что устранение медленных волн является следствием ингибирования механизма генерирования медленных волн и не вызвана деполяризацией.
В: Уменьшение интесивности света на 1/3 от того, что было в опыте А значительно удлиняет период иллюминации, требуемый для устранения медленных волн. В этом эксперименте наблюдались медленные волны большей продолжительности во время периода деполяризации. Медленные волны устранялись при величине мембранного потенциала покоя –42 мВ.
График 2. Эффекты мембранного потенциала на активность медленных волн.
А: после 45 минутной инкубации в МС и промывки в растворе Кребса, препараты освещались с 1/3 максимума интенсивности до тех пор пока амплитуда медленных волн не станет равна половине таковой в растворе Кребса. Препараты были реполяризованы к такому же мембранному потенциалу покоя как и в растворе Кребса. В данном случае восстановления амплитуды медленных волн не наблюдалось.
В: в противоположность этому, в случае когда деполяризация была вызвана повышением внеклеточной концентрации К+ до 15 мМ в растворе глюкамин-нитрендипин-Кребса, реполяризация препаратов ИКК-ЦМ с использованием метода анологичному в опыте А полностью восстанавливала амплитуду медленных волн. Кроме того, амплитуда медленных волн также восстанавливалась после промывки.
Таблица 3. Устранение активности медленных волн МС+свет без заметной деполяризации. Медленные волны устранялись в МС окрашенных препаратах ИКК-ЦМ с освещением 1/3 максимума интесивности света на протяжении 8,5 минут. Медленные волны Медленные волны устранялись при величине потенциала –64 мВ, что равно истинной величине мембранного потенциала покоя препаратов циркулярных мышц в растворе Кребса. (см. График 4)
Таблица 4. Электрофизиологические эффекты МС+свет на препараты ЦМ. Препараты ЦМ, лишённые подмышечной сети ИКК и нескольких прилежащих слоёв ГМК были спонтанно помежены в раствор Кребса. Инкубация в 50 мМ МС не вызвала изменений мембранного потенциала, чего не сделала и 3 минутная иллюминация с максимумом интенсивности. Было показано, что препараты ЦМ жизнеспособны при стимуляции 0,5 мМ BaCl2 + 0,1 BAY K 8644.
Изображение 5.
А: электронная микрофотография подслизистого края в контрольной ткани. Иллюминация с максимальной интенсивностью в течении 10 минут без преинкубации в МС не имеет эффектов на ультраструктуру ИКК ( митохондрии не конденсированы), тонкие нерегулярные ветвистые гладкомышечные клетки (ВГМК), нервы (Н) и собственно циркулярные мышцы (ЦМ).
SUB: подслизистая
В и С: обратите внимание, ИКК после инкубации в МС в течении 45 минут, без последующей иллюминации (В) или с 2 минутной иллюминацией с максимумом интенсивности (С) претерпели изменение конформации митохондрий от конденсированной в ортодоксальную. В отличие от этого, ультраструктура сохранена, включая щелевые контакты (ЩК).
Изображение 6. Ткань инкубированная в МС в течении 7 минут с последующей иллюминацией максимумом интенсивности в течении 2 (А) и 10 минут (В).
А: после 2 минутной иллюминации единственные ультраструктурные изменения - это появление митохондрий с ортодоксальной конформацией ( сравните с изображением 5С: 45 мин в МС, 2 мин в свете). IC – интерстициальные клетки Кэйджела, bSM - тонкие нерегулярные гладкомышечные клетки, CM - собственно циркулярные мышцы, N – нерв подмышечного сплетения.
В: после 10 минутной иллюминации, ИКК серьёзно повреждены – дизинтеграция цитоплазматических органелл и разрывы плазматической мембраны. Базальная пластинка ещё интактна. Отростки ВГМ и ЦМ клеток повреждены значительно меньше.
Изображение 7.
А: Слабосильная электронная микрофотография ткани освещённой в течении 10 минут с максимумом интенсивности после 7 минутной преинкубации в МС. Нет никакого указания на структурые повреждения собственно ЦМ, внутримышечных капилляров (К) и фибробластов (Ф), в то время как слой клеток, граничащих с субмукозой (СУБ) значительно поражён.
В: при высоком увеличении ( те же условия ) большие повреждения ограничены ИКК богатыми митохондриями, в то время как тонкие нерегулярные ВГМК, ЦМ и нервы не повреждены. Сохранены щелевые контакты между глубоко лежащими ЦМ клетками и между ИКК.