МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ

ОДЕССКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. И.И.МЕЧНИКОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра микробиологии, вирусологии.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ
ДИАГНОСТИКИ ТРИХОМОНОЗА

Квалификационная работа бакалавра

студента пятого курса заочного отделения

БОГУША Андрея
Николаевича

Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент

Панченко Николай Никитович

Допущена к защите Защищена на заседании ДЕК
“____”_________2004р. “____”__________2004р.
Протокол заседания с оценкой_________________ кафедры №____________ Протокол №____________
Заведующий кафедры Секретарь ДЕК_____________

______________________

ОДЕССА-2004

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………………..3
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………………...……………5
1.1.Систематика и биологические особенности трихомононад…………….……..5
1.1.2. Метаболизм T.vaginalis………………………………………………………….7
1.1.3. Культуральные свойства трихомонад………………………………….………8
1.2. Устойчивость к физическим, химическим факторам и во внешней среде……8

1.2.1. Условия инфицирования трихомонадами………………...……………..…….9
1.3. Механизмы патогенеза урогенитальной инфекции трихомонадной этиологии…..…………………………………………………………………………..10
1.3.1. Клиника трихомоноза у мужчин………………………………………………12
1.3.2. Клиника трихомоноза у женщин………………………………………...……14
1.4. Методы диагностики трихомоноза………………………..…………………….15
1.4.1. Микроскопия нативных и окрашенных препаратов……….………………..16
1.4.1.1. Метод смывов…………………………………………..…………………….16
1.4.1.2. Микроскопия нативных препаратов…………………………….….……….17
1.4.1.3. Микроскопия окрашенных препаратов…………………………….…....….18
1.4.2.Культуральное исследование……………………………………….…………21
1.4.3.Иммунологическиеметоды……………………………………….…………….22
1.4.4.Методы генной диагностики T.vaginalis…………………….…….…………..23
1.5.Лечение трихомоноза……………………………………………….……………24
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...………………………………25
2.1. Исследование культуральным методом………………………………………...25
2.2 Исследование методом микроскопии мазка…………………………………….26
2.3. Исследование методом ПЦР…………………………………………………….27
3.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ……………………...28
3.1.Анализ данных выявления T.vaginalis у жителей Одесского региона………...30
ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………...33
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………………………………34

Введение

Трихомоноз является одним из наиболее распространённых заболеваний мочеполового тракта и занимает первое место среди болезней, передаваемых половым путём. Инфекция имеет «космополитический» характер, от неё страдают 170 миллионов человек на земном шаре.

Это широко распространённое паразитарное заболевание, вызываемое
Trichomonas vaginalis одинаково часто поражающее, как мужчин, так и женщин. Урогенитальная трихомонада была впервые описана 1863 году. Парижский врач Допле обнаружил её в выделениях из влагалища больных женщин и дал ей название, которым пользуются и по настоящее время. Трихомонады выявляются у 10% «здоровых» женщин и более чем у 30% имеющих явные клинические проявления. В тропических странах этот показатель изменяется от 15 до 40% .Оценки частоты пораженности мужчин в разных странах резко отличаются.
Так, в докладе Научной группы ВОЗ отмечается, что трихомонады редко бывают причиной не гонококковых уретритов. В Польше патология составляет около 4% всех НГУ у мужчин, в Болгарии – 10%, в странах СНГ – от 23 до 47%.

Частота инфицирования трихомонозом клинически здоровых женщин в развитых странах составляет 2-10%. В США ежегодно регистрируют примерно 3 млн. новых случаев заболевания женщин (это приблизительно
2,4%). В России в 1996 году на 100 тыс. населения зарегистрировано 399
(0,34%) случаев заболевания[3,8].

Подробную характеристику заболеваемости трихомонозом московской популяции в возрастной группе от 14 до 59 лет мужчин и женщин дал
М.М. Васильев [9]. Среди больных трихомонозом и смешанной гонорейно - трихомонадной инфекцией подавляющее число пациентов были незамужнем
/неженаты или разведены (практически 80%). Как правило, возраст больных трихомонозом и смешанной инфекцией женщин колебался в пределах 18-39 лет, мужчин – 15- 39 лет. Последние данные подтверждают мировую практику – болезнь охватывает население, ведущее активную половую жизнь. Заболевание протекало с минимальными клиническими проявлениями, а зачастую и без них! Поэтому чаще трихомоноз выявлялся при профилактических осмотрах и привлечении к обследованию половых партнёров. При этом трихомонадное носительство выявлялось у 40- 50% больных смешанной урогенитальной инфекцией[4,11,12,28,40].

Учитывая всё выше изложенное, изменить ситуацию в лучшем направлении, можно разработав политику проведения массового скрининга. А это, невозможно не имея доступных, точных и надёжных методов и средств экспресс диагностики трихомоноза.

Целью настоящей работы была оценка степени надёжности и эффективности методов лабораторной диагностики трихомоноза. А так же анализ статистических данных по выявлению трихомонозов, в Одесском регионе за период 1998-2003 годы.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Систематика и биологические особенности трихомонад

Возбудителем заболевания является Trichomonas vaginalis, он относится к царству высших протистов – Protozoa, классу жгутиковых – Flagella, семейству - Trichomonadidae, роду – Trichomonas. В организме человека существует три вида трихомонад: Trichomonas tenax (elongata),
Trichomonas hominis (abdominalis), Tricomonas vaginalis. В ротовой полости чаще присутствует Trichomonas tenax. При диспепсических расстройствах, обычно у детей выделяют коменсал толстого кишечника –
Trichomonas hominis[24,27,31,32].

Возбудитель имеет овально – грушевидную, продолговатую, многоугольную и другие формы в зависимости от встречаемых на пути препятствий. Размеры трихомонад колеблются от 8 до 40 мкм и более. Мелкие особи выявляются при остром, крупные при хроническом течении процесса. Снаружи возбудителя имеется тонкая оболочка - перипласт, снабженная в передней части тела щелью – цистомой крючкообразной формы, выполняющей функцию рта. Тело трихомонад состоит из тонкозернистой протоплазмы с многочисленными вакуолями.

В передней части тела паразита расположено ядро продолговато – овальной формы, круглой или грушевидной формы, содержащей 5 – 6 ядрышек. Рядом с ядром находится несколько телец в виде зерен, называемых блефоропластом, от которого начинается прямая осевая нить аксонем (аксостиль), представляющая собой упругий тяж, расположенный внутри протоплазмы по длинной оси и выступающий наружу в виде шипа. На переднем конце тела трихомонады имеется четыре свободных жгутика, отходящих от блефаропласта.
Пятый жгутик идет назад, примерно до трети длины тела, образуя край ундулирующей мембраны, сформированной из перипласта.

Благодаря движениям жгутиков и волнообразной (ундулирующей) мембране трихомонады могут активно перемещаться. Они способны образовывать псевдоподии, обеспечивающие амебовидное движение.
Высокая пластичность цитоплазмы позволяет трихомонаде внедряться в очень узкие промежутки между клетками. Поэтому трихомонады могут существовать в жгутиковой и амебовидной форме, при которой движения жгутиков не видны. Перемещение возбудителя происходит настолько медленно, что он кажется неподвижным. В такой (неподвижной) стадии трихомонады либо совсем лишены жгутиков, либо прижимают их к телу, вследствие чего их нельзя рассмотреть.

Электронно – микроскопически подтверждено существование круглых неподвижных форм трихомонад, лишенных ядра и жгутиков. В мочеиспускательном канале у мужчин их содержится меньше, чем у женщин, и они малоподвижны.

Питается трихомонада эндоосмотически и путём фагоцитоза.
Оптимальная среда для её существования рН 5,2 – 6,2. Именно поэтому наиболее благоприятные условия для трихомонад создаются после менструации. Трихомонады не образуют цисты или других форм устойчивости обеспечивающих им сохранение вне человеческого организма.

Влагалищная трихомонада представляет собой самостоятельный вид, в естественных условиях обитает только в мочеполовом аппарате человека и не поражает животных. У женщин местом обитания
Trichomonas vaginalis является влагалище, у мужчин – предстательная железа и семенные пузырьки[35,39].

2. Метаболизм T. Vaginalis

Несмотря на то, что трихомонады по многим характеристикам напоминают эукариоты, они отличаются по энергетическому метаболизму и имеют много общего с примитивными анаэробными бактериями.
Трихомонады имеют - гидрогеносомы, окружённые двойной мембраной, которые являются более совершенными аналогами митохондрий и выполняют схожие метаболические функции.

T. vaginalis демонстрирует черты, являющиеся общими для всех анаэробов в отношении углеводного и энергетического метаболизма, что контролируется ферментами, работающими, как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Продукты метаболизма включают: ацетат, лактат, малат, глицерол, СО2, а в анаэробных условиях - водород.

T.vaginalis - это облигатный паразит, потерявший способность самостоятельно синтезировать многие макромолекулы (пурины, пиримидины, липиды), поэтому важнейшие питательные компоненты трихомонады получают из вагинального, уретрального секрета при фагоцитозе эпителия и бактериальных клеток из состава симбиотической и условно – патогенной микрофлоры мочеполовых путей. Последнее обстоятельство диктует необходимость включения в культуральную среду для роста T. vaginalis все важнейшие макромолекулы, витамины и минералы. Для репродукции трихомонад особенно важна сыворотка крови, содержащая липиды, жирные кислоты, аминокислоты и следы металлов[9,19,22,33,47].

1.1.3 Культуральные свойства трихомонад

Трихомонады хорошо растут в анаэробных условиях, оптимум их роста при рН среды 5,5 – 7,5 и температуре 35 – 37 градусов
Цельсия. Культура Trichomonas vaginalis в отличие от других культур трихомонад не способна к гемолизу, плазмокоагуляции, хорошо разлагает глюкозу, мальтозу, крахмал, слабо – лактозу, не образует сероводорода и индола.

Влагалищную трихомонаду можно культивировать на питательных средах, на клеточных культурах и куриных эмбрионах. Наиболее пригодная среда для культивирования - печёночная среда с цистеином, пептоном и мальтозой. Культивируют от 3 до 5 суток[37,39].

1. Устойчивость к физическим, химическим факторам и во внешней среде

Вне организма человека трихомонада быстро теряет жизнеспособность. В течении нескольких секунд погибает от высушивания, при термической обработке в диапазоне до 55 градусов
Цельсия она сохраняет жизнеспособность - 30 секунд. На трихомонаду губительно действуют прямые солнечные лучи. При исследовании секрета простаты, возбудитель гибнет (визуально теряет всякую подвижность) за время пока мазок несут к микроскопу.

Среди химических веществ бактерицидно действует раствор ртути дихлорида (1:1000 – 1:1500), карболовой кислоты (1%) и хлорамин Б
(1%).

Трихомонада остаётся жизнеспособной при температуре -10 градусов
Цельсия до 22-45 минут, при температуре 1-4 градуса Цельсия в течении 96-114 часов. Возбудитель также сохраняет жизнеспособность в некоторых биологических жидкостях и выделениях человека. В сперме и моче трихомонады жизнеспособны до суток, несколько часов они выживают во влажном чистом белье[23,39].

1. Условия инфицирования трихомонадами

Источником инфекции является больной человек, или трихомонадоноситель. В неполовое заражение встречается редко, преимущественно у девочек (через мочалки, ночные горшки, латексные перчатки, медицинские инструменты). Это возможно благодаря тому, что в комочках гноя или слизи урогенитальные трихомонады в течение нескольких часов сохраняют жизнеспособность (до высыхания субстрата или до полного перемешивания его с водой). Водный путь инфицирования отвергается, хотя допускается возможность заражения женщин при совместном приёме ванн, со слабо минерализованной водой, близкой к изотоническому раствору. В акушерской практике часто происходит инфицирование новорожденных от больных матерей.

Для детей характерна очаговость инфекции. Такими очагами могут быть семья, детский коллектив. Заражение происходит при непрямом контакте. Однако при любом пути передачи источником является больной человек или носитель урогенитальных трихомонад.

Вероятность заражения во время полового акта, превышает 80%.
Причем этот показатель имеет закономерность с продолжительностью коитуса, и с долей морально гигиенических аспектов.

Мужчины в силу анатомо-физиологических особенностей риску заражения подвержены в меньшей степени, чем женщины. Однако у 60 –
80% имевших половые контакты с больными трихомонозом женщинами паразиты обнаруживаются. У женщины, явившейся источником заражения мужчин трихомонозом, возбудитель выявляется в 100% случаев.

В тех случаях, когда половой акт происходит с использованием барьерных или химических методов контрацепции, случаев заражения практически не отмечают. Некоторые мужчины после коитуса практикуют метод задержки мочи в уретре (путём пережимания крайней плоти), ошибочно полагая добиться трихомонацидного эффекта. Подобная практика часто приводит к тому, что трихомонады поражают не только уретру, а и дистальные отделы мочеполового тракта мужчины. Вероятность развития простатита в этих случаях намного выше, чем при обычном течении трихомоноза, когда вначале поражается только уретра[9,13,14].

2. Механизмы патогенеза урогенитальной инфекции трихомонадной этиологии

Для трихомоноза присущи четыре фактора патогенеза такие, как: интенсивность инфекционного воздействия, рН – влагалищного и других секретов, физиологическое состояние эпителия мочеполовой системы, сопутствующая бактериальная флора.

T.vaginalis выделяет во внешнюю среду «клеточный разъединяющий фактор» рассматривающийся как средство, с помощью которого паразит проникает в межклеточное пространство и, разрыхляя ткань, способствует проникновению в субэпителиальные слои бактерий, что в итоге формирует очаг воспаления.

T.vaginalis способна избегать литического действия комплемента и клеточно – опосредованных реакций иммунного ответа хозяина, что является важнейшим аспектом патогенеза заболевания.

Устойчивость влагалищных трихомонад к комплементу зависит от высокой концентрации в них ионов железа, которые паразит в избытке способен получать из менструальной крови. Известно, что ионы железа регулируют экспрессию протеазных белков, которые способствуют разрушению С3 – компонента комплемента на поверхности микроорганизма, и позволяют паразиту избегать комплемент – зависимого лизиса.
Необходимо учитывать, что влагалищные трихомонады, подобно другим паразитам, секретируют высокоимуногенные антигены, которые способны нейтрализовать антитела или цитотоксические антигены, которые способны нейтрализовать антитела или цитотоксические Т – лимфоциты.
Кроме того, T.vaginalis может сорбировать на своей поверхности белки плазмы (антигенная мимикрия), что не позволяет иммунной системе идентифицировать паразита, как чужеродный организм.

Таким образом, показано, что трихомонадная инфекция не приводит к развитию выраженного иммунного ответа. Выявление у больных или переболевших трихомонозом лиц сывороточных и секреторных антител является лишь свидетельством существующей или перенесенной инфекции, но не способностью обеспечить стойкий иммунитет.
Реинфекция T.vaginalis у человека не вызывает иммунной защиты.
Клинические проявления урогенитального трихомоноза отличаются большим разнообразием: от острых форм с ярко выраженными симптомами воспаления до мало и асимптомного течения заболевания.
Патогномоничных клинических (субъективных и объективных) признаков трихомоноза нет, также не обнаружены специфические морфологические изменения в пораженных органах и тканях. Определяющую роль в патогенезе T.vaginalis играет формирование различных ассоциаций влагалищной трихомонады с патогенными и условно – патогенными микроорганизмами урогенитального тракта, а также ответной реакции макроорганизма. Если сила ответной реакции макроорганизма превышает
«агрессивность» инфекционного агента, то клиника острого воспаления, как правило, не развивается, а напротив, слабый иммунный ответ способствует реализации патогенных и вирулентных свойств возбудителя.

T.vaginalis, попадая в уретру, фиксируется на клетках плоского эпителия слизистой оболочки, проникая в железы мочеиспускательного канала и лакуны.
Попав в мочеполовые органы, она обуславливает развитие воспаления или остаётся незамеченной. Умерено выраженная воспалительная реакция развивается при наличии большого количества паразитов[1,2,3,6,9,13,15].

1.3.1 Клиника трихомоноза у мужчин

У мужчин трихомонады могут поражать уретру, её железы, семенные пузырьки, простату, придатки яичка, куперовы железы, пара уретральные протоки, железы крайней плоти, мочевой пузырь, почечные лоханки.

Уретрит – наиболее частое поражение. Различают свежий и хронический. Течение свежего уретрита чаще подострое и торпидное, реже острое. При остром и подостром течении уретрита наблюдаются обильные гнойные выделения из уретры, при торпидном течении – скудные, водянистые, слизисто гнойные или слизистые. У некоторых больных выделения пенистые. Субъективные ощущения непостоянны и обычно маловыражены: част это зуд и жжение в мочеиспускательном канале; иногда может возникать боль во время мочеиспускания. Диуретические расстройства выражены слабо.

Обильные выделения при острой и подострой формах уретрита за 1
– 2 недели, самопроизвольно уменьшаются, и заболевание становится малосимптомным. У части больных уретрит начинается с не резко выраженных явлений, но затем постепенно усиливается, приобретая острый и подострый характер.

Хронические уретриты отличаются вялым течением с периодическим обострением патологического процесса. У 63% больных заболевание характеризуется малосимптомностью, скудными гнойными выделениями или слизисто – гнойными выделениями, у 37% преобладают симптомы осложнений, а уретрит остаётся незамеченным больными.

Воспалительный процесс недолго ограничивается передней уретрой.
Довольно скоро развивается тотальный уретрит. Учащённое мочеиспускание, императивные позывы, боли в конце мочеиспускания, пиурия, терминальная гемотурия наблюдаются только при остром течении. В торпидных случаях клинические признаки заднего уретрита отсутствуют. Он обычно распознаётся по патологическому составу второй порции мочи и данным уретроскопии.

Изменения, выявленные при уретроскопии у мужчин, страдающих трихомонозом, мало, чем отличаются от эндоскопической картины при гонорейном уретрите.

Простатит, возникает в у 10,6 – 27,8% больных. Возможно, установить только после взятия секрета железы.

Эпидимит, встречается чаще, чем при гонорее, носит всегда односторонний характер. У 30% течение острое, у 70% наблюдается кратковременный подъем температуры.

Везикулит, сопутствует эпидимиту и простатиту и не сопровождается обычно субъективными расстройствами. Везикулиты иногда ведут гемоспермии. Часто поражаются лакуны – литтеровских желёз, тизониевых желёз и пара уретральных протоков.

Стриктуры уретры, развиваются в 5 – 8,4% случаев и выявляются только при уретроскопии, на отток мочи не влияют.

Цистит, по клиническому течению ничем не отличаются от циститов другой этиологии. При цистоскопии выявляется диффузная гиперемия слизистой треугольника. В моче, взятой катетером, иногда обнаруживают трихомонады и бактериальную флору. Восходящая инфекция верхних мочевых путей развивается очень редко.

Трихомонады у части больных поражают кожу гениталий. Они чаще развиваются у женщин. По своему проявлению поражения могут напоминать шанкриформную пиодермию, первичную сифилому, в других случаях образуются язвы с неправильными подрытыми краями с гнойным налётом на дне. Однако более часты неправильной формы эрозии с ярко – красным дном[34,35,38].

2. Клиника трихомоноза у женщин

Характеризуется многоочаговостью поражения. В патологический процесс вовлекается преимущественно нижний отдел мочеполового тракта
(86%). Восходящий процесс развивается у 14% больных. Прежде всего, у женщин поражаются уретра, влагалище и канал шейки матки.
Преобладает развитие вульвовагинита.

Вульвит и вестибулит. При остром течении процесса больные жалуются на жжение в области гениталий, зуд и бели. Кожа больших половых губ и слизистая оболочка преддверия становятся отечными, гиперемированными и покрываются гнойно-слизистыми серого цвета выделениями, ссыхающимися в корки, при удалении которых на слизистой обнаруживаются эрозии. Под влиянием обильных выделений возникает дерматит на внутренней поверхности бёдер. При хроническом течении заболевания возможен зуд и менее обильные выделения. При осмотре отмечается очаговая гиперемия слизистой вульвы

Уретрит. Почти у половины больных протекает без субъективных ощущений, у остальных - преимущественно с острым течением. Имеются жалобы на резь и болезненность при мочеиспускании, императивные позывы на мочеиспускание и болезненность при вовлечении в патологический процесс шейки мочевого пузыря. При осмотре выявляются гиперемия и отёк губок уретры, пальпаторно устанавливается её инфильтрация. При массаже уретры выделяется капля гнойного или гнойно- слизистого содержимого, в котором можно обнаружить трихомонады.

Хронический уретрит обычно протекает асимптомно, сопровождается скудным отделяемым и уплотнением в виде тяжа уретры.

Нередко в патологический процесс вовлекаются парауретральные ходы.
Вокруг их устьев развивается гиперемия слизистой, а при пальпации обнаруживается уплотнение в виде маленького тяжа или узелка. При уретроскопии слизистая обычно гиперемирована или бледная, сосуды плохо различимы, складки неравномерны, сглажены.

Бартолинит. Общие расстройства отсутствуют, боль в области бартолиновой железы.

Вагинит. Самая частая форма трихомоноза. При остром течении наблюдаются обильные жидкие, гнойные, пенистые бели, разъедающие выделения, количество которых значительно меньше при хроническом процессе. Слизистая влагалища диффузно гиперемирована. Иногда заболевание может протекать по типу макулёзного, гранулёзного и эрозивного вагинита, а хронические поражения - нередко без выраженных клинических симптомов.

Эндоцервицит. Сопровождается гиперемией слизистой и отёком шейки матки, обильными выделениями из шеечного канала, под влиянием которых образуются эрозии, приобретающие фолликулярный характер при хроническом течении процесса. При стихании воспалительного процесса нередко остаётся трихомонадоносительство.

Восходящий трихомоноз. Проявляется в виде метроэндометрита (46%)
, периметрита и аднексита (46%)[20,26,28,39].

1.4 Методы диагностики трихомоноза

В настоящее время в нашей стране и за рубежом применяют четыре лабораторных метода определения T.vaginalis: микроскопический, культуральный, иммунологический и генодиагностический.

Все методы диагностики трихомоноза у мужчин менее надежны, чем у женщин, так как в отделяемом уретры у мужчин, как правило, содержится значительно меньше возбудителей, которые часто малоподвижны. Условия обитания паразитов в мужской уретре и во влагалище женщин резко различаются. Это не может не повлиять на T. vaginalis, приспособительные формы, которой у мужчин и женщин обычно различны. Трихомонады в этом отношении не отличаются от многих видов микроорганизмов, фенотип которых изменяется в зависимости от среды обитания и внешних условий. Для того чтобы получить более надежные данные, необходимо придерживаться следующих правил:

1. Отрицательный результат любого исследования не исключает наличие трихомонад; все виды исследований необходимо выполнять многократно.

2. Исследования полученного материала проводить одновременно всеми методами.

3. Для оценки использовать не только уретральное отделяемое и секрет предстательной железы, но и осадок свежевыпущенной мочи, секрет бульбоуретральных желез, спермы[5,22,35].

1.4.1 Микроскопия нативных и окрашенных препаратов

Лучшие результаты получают при исследовании не свободно стекающих выделений, а соскобов и смывов из уретры, так как трихомонады локализуются преимущественно в ее лакунах и железах.

1.4.1.1 Метод смывов

Метод смывов позволяет получить материал для нативных препаратов и посевов при минимальном количестве отделяемого. С этой целью на прокипяченную стеклянную трубку длиной 12 – 15 см. с оплавленными концами надевают резиновый баллончик и набирают в нее слегка подогретый изотонический раствор хлорида натрия или раствор Рингера – Локка (0,5 – 1 мл). После удаления свободно стекающих выделений и легкого массажа уретры в ее наружное отверстие вставляют трубку. Раствор несколько раз вдувают в уретру и снова засасывают в трубку. Таким образом, с ним смешивается отделяемое передней части уретры и содержимое желез и лакун. Смыв выпускают во флакон из-под пенициллина, откуда его можно перенести на предметное стекло или засеять. Центрифугирование смывов облегчает поиск трихомонад[9,37,38].

1.4.1.2 Микроскопия нативных препаратов

Наиболее доступный и точный метод, так как типичные трихомонады нельзя спутать другими микроорганизмами и клетками, встречающимися в мочеполовых органах. Нативный препарат готовят методом висячей или раздавленной капли.

Густое отделяемое разбавляют теплым изотоническим раствором хлорида натрия, чтобы облегчить перемещение трихомонад. Активная подвижность, присущая трихомонадам во влагалищном секрете, выделяемом мужской уретры наблюдается редко. Чаще отмечаются толчкообразные движения или только колебания жгутиков и ундулирующей мембраны. Препараты рассматривают в обычном микроскопе со слегка спущенным и задиафрагмированным конденсором
Аббе, в результате чего создается необходимая контрастность. Используют также конденсоры темного поля и фазово-контрастной микроскопии.

Иногда для более рельефного выделения трихомонад нативному препарату добавляют каплю раствора Люголя, флюоресцеина. Прекратившее движение или малоподвижные трихомонады в нативных препаратах не распознаются. Кроме того, движения трихомонад быстро прекращаются при охлаждении и высыхании препарата, поэтому мазки необходимо исследовать сразу же после получения материала[9,14,15,37].

1.4.1.3 Микроскопия окрашенных препаратов

Удобно, поскольку не требует немедленного изучения взятых мазков. В них удается различить не только типичные подвижные, но и малоподвижные
(амебоидные) трихомонады, в нативных же препаратах выявление атипичных паразитов, не обладающих, как правило, активной подвижностью, весьма затруднительно.

Разработаны различные методы окраски. Одни из них позволяют рассмотреть органоиды паразита, но из-за сложности их используют лишь при научных исследованиях (например, окраска по Гейденгану). Другие методы, более простые (по Лейшману, по Романовскому - Гимзе), н всегда позволяют отличить жгутики, аксостили и блефанопласты, которые служат опознавательными признаками трихомонад. Многие предпочитают окраску метиленовым синим. Опыт проведения микроскопии позволяет утверждать, что в правильно окрашенных метиленовым синим мазках подвижные (типичные) трихомонады имеют достаточно характерный вид. Однако диагностика атипичных (амебоидных) трихомонад более сложна и ответственна, требует большей осторожности и иногда оставляет место для сомнения. Вот почему при обнаружении атипичных форм следует воздержаться от категорического заключения, которое может быть причиной гипердиагностики. Приготовление мазка: выделения наносят на чистое предметное стекло и осторожно размазывают по нему другим стеклом. При грубом размазывании столь нежные клетки как трихомонады, легко раздавливаются, что затрудняет их распознавание. При фиксации над пламенем трихомонады также деформируются. После забора материала слегка высушенные на воздухе не фиксированные препараты сразу же окрашиваются 1% водным раствором метиленового синего в течение двух – трех минут, а затем промывают обычной водой и высушивают на воздухе.

Окрашенные метиленовым синим «типичные трихомонады» имеют нежную сетчатую, пенистую цитоплазму светло-голубого цвета. Интенсивно окрашенный перипласт четко очерчивает границы тела. Компактное темно-синее с фиолетовым оттенком маленькое ядро находится обычно у переднего конца тела, реже в центре. Оно имеет форму косточки сливы или неправильную форму и не превышает 1/3 длины тела. В цитоплазме содержатся вакуоли, наиболее крупные из которых располагаются вблизи ядра. В них могут быть заключены бактерии и пищевые частицы. В цитоплазме видны также темные гранулы диаметром 0,2 – 1 мкм. Длина колеблется от 12 до 30 мкм и более. Хотя жгутики и другие органоиды не видны (лишь изредка окрашивается аксостиль), а препарат имеет однотипную окраску, эти особенности позволяют легко дифференцировать трихомонады от клеток эпителия, а также лейкоцитов с бледной, равномерно окрашенной цитоплазмой и круглым или овальным ядром в центре.

Иначе выглядят атипичные, амебоидные трихомонады. Они различаются по форме и величине, но преобладают особи круглой или овально формы, диаметром
15 – 35 мкм и более. Границы тела четко очерчены тонкой, синей линией перипласта. Цитоплазма еще более светлая из-за большого количества вакуолей с отдельными включениям и зернами, иногда скапливающимися около ядра.
Овальное или неправильной формы, реже круглое ядро составляют половину длины тела паразита, располагаясь эксцентрично. Оно окрашивается не столь интенсивно, но, как правило, четко отделено от цитоплазмы. В ядре видны немногочисленные глыбки хроматина и светлая строма. В вакуолях не редко заметны захваченные бактерии и клеточные обломки. По этому описанию легко отличить трихомонады от мононуклеарных лейкоцитов и клеток эпителия. Трудно дифференцировать амебоидные трихомонады от макрофагов с дегенеративными изменениями. Правда, такие макрофаги почти никогда не встречаются в уретре.
Лишь при остром гонококковом воспалении изредка обнаруживают макрофаги и двуядерные плазматические клетки. Макрофаги располагаются скоплениями, количество их увеличивается в начале периода выздоровления, вакуолизация бывает только при очень высокой вирулентности бактерий, которые обычно не инфицируют уретру. Трихомонады, как правило, единичные в поле зрения, после выздоровления исчезают, экссудат часто не содержат микробов, у них не бывает очень больших вакуолей. Ядро макрофага круглое, овальное или бобовидное, относительно гомогенное: иногда в нем видно одно или несколько ядрышек, общая окраска его темная. Ядро трихомонады, наоборот, состоит из нескольких отчетливо различающихся глыбок хроматина, заключенных в общую оболочку с более светлой стромой.

Подтверждением того, что указанные выше клетки являются трихомонадами атипичной (амебовидной), формы, служат следующие факты:

Их находят одновременно с типичными паразитами, а также у тех больных, у которых подвижность трихомонад отсутствует, но которые являлись источником заражения трихомонозом нескольких человек.

1. Они исчезают после противотрихомонадного лечения и появляются вновь лишь при рецидивах и реинфекциях.

2. Метронидазол (трихопол) эффективен при лечении больных, у которых в абактериальном отделяемом обнаружены такие клетки.

3. При хроническом уретрите и рецидивах типичные трихомонады появляются у больных, у которых в острой стадии обнаруживаются только эти клетки.

4. Они отсутствуют у больных с другими формами уретритов, если нет смешанной инфекции.

5. Типичные трихомонады обнаруживают у большинства половых партнерш лиц, которым диагноз трихомоноза был установлен на основании обнаружения этих клеток.

6. При посеве материала от больных, у которых выявлены такие клетки, нередко вырастают типичные трихомонады.

Представляет интерес то обстоятельство, что типичные подвижные трихомонады чаще выявляют при хроническом и торпидном уретрите, нередко осложненном хроническим простатитом, тогда как при острых уретритах обнаруживают мало паразитов - в основном атипичные амебоидные формы[7,10,14,15,19].

1.4.2 Культуральное исследование

Служит важным звеном лабораторной диагностики трихомоноза у мужчин и женщин, особенно при распознавании атипичных форм паразитов и выявлении их у лиц, получавших противотрихомонадные препараты при трихомонадоносительстве. Разумеется, посевы необходимо проводить параллельно микроскопии нативных и окрашенных препаратов и повторять при отрицательных результатах.

Разноречивая оценка культурального метода диагностики трихомоноза связана, в первую очередь, с использованием нестандартных питательных сред, нередко обладающих низкими качествами. Достаточной чувствительностью обладает среда СКДС, разработанная В. Н. Бедновой. Среди импортных высоким качеством обладают также среды «Diamon», «Kupferberg», «Asani», а также тест – система «Трихомоно-Скрин» Дмитриева .

Метод выращивания трихомонад в бульонной культуре - "золотой стандарт" для диагностики, потому что это простой в интерпретации метод и требует менее чем 300-500 трихомонад/мл инокулюма для начала роста в культуре. Тем не менее, для него существуют ограничения, присущие культуральным методам.
Для диагностики необходим инкубационный период от 5 до 7 дней, являющийся слишком длительным из-за возможности инфицированного пациента к распространению инфекцию. В связи с этим он не получил широкого применения в клинической практике в качестве прямого диагностического метода.

Для улучшения восприятия культурального метода, за рубежом был разработан метод пластикового конверта, с помощью которого можно выполнить как немедленную проверку присутствия трихомонады, так и сохранить дальнейший рост трихомонад в одной самоподдерживающейся системе. Полученные результаты сравнимы с таковыми при исследовании мазка и культур. Аналогично пластиковому конверту используется система «InPouch» в виде двухкамерного мешка, позволяющая выполнить быструю проверку культуры путём микроскопии через стенку мешка.

Технология роста патогена на клеточной культуре использует свойства клеточных линий восстанавливать рост T.vaginalis из клинических образцов.
Было продемонстрировано, что этот метод даёт лучшие результаты - относительно культивирования в бульоне и приготовления влажной камеры, поскольку способен определять T.vaginalis в концентрациях менее 3 организмов в 1 мл. Однако культивирование в культуре - это не простой рутинный метод; он дорог и неудобен для быстрой диагностики[5,9,
14,15,22,29,36,37]

1.4.3 Иммунологические методы

Ограничения культуральных и микроскопических методов для выявления
T.vaginalis заставили учёных развивать альтернативные методы, которые могут определять антиген, антитело или нуклеиновые кислоты в уретральном или вагинальном экссудате. Иммунологические методы не получили должного распространения из-за отсутствия качественных отечественных тест-систем.
Кроме этого, все методы серологической диагностики T.vaginalis мало информативны, т. к данный антиген не вызывает 100%-го иммунного ответа.
Хотя для подтверждения диагноза ими можно воспользоваться. Используются различные методы определения антител: агглютинация, непрямая гемаглютинация, диффузия в геле, флюоресценция антител и иммуноферментный анализ, метод иммуноблотинга. Определённое диагностичическое значение имеет прямое определение специфических белков T.vaginalis в биопробах с использованием моноклональных антител в качестве быстрого метода диагностики трихомоноза. Прямой иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализ мазков вагинального соскоба (тест-система фирмы California
Integrated Diagnostics, Benicia, Calif.), использующий перокидазо - и флюорохром - меченые смеси моноклональных антител к различным структурам
T.vaginalis был таким же чувствительным и специфичным, как и используемый культуральный метод. К том