Объект исследования: сыворотка крови практически здоровых людей и больных сальмонеллезом г. Пензы.
Практическое применение: в здравоохранении.
Список сокращений.
ПОЛ – перекисное окисление липидов;
ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы;
ЧСА – человеческий сывороточный альбумин;
МДА – малоновый диальдегид;
ПЭГ – полиэтиленгликоль;
АОС – антиокислительная способность;
АТ – антитело;
АГ – антиген;
ИК – иммунный комплекс;
ЛПС – липополисахаридный комплекс;
МСМ – молекулы средней массы;
ТБК – тиобарбитуровая кислота;
ЭКА – эффективная концентрация альбумина;
ОКА – общая концентрация альбумина;
ТХУ – трихлоруксусная кислота;
ЦНС – центральная нервная система;
ц-АМФ – циклический аденозинмонофосфат;
АФК – активные формы кислорода;
LOOH, HOOH – гидроперекиси;
СОД – супероксиддисмутаза.
Содержание.
Введение………………………………………………………………..
1. Обзор литературы ………………………………………………...
1.1. Биохимическая характеристика интоксикации при сальмонеллезной инфекции…………………………..……..
1.2. Молекулярные механизмы развития эндогенной
интоксикации при сальмонеллезе……………………..…..
1.3. Показатели уровня эндогенной интоксикации
организма при сальмонеллезе……………………………….
2. Материалы и методы исследования………………………….
2.1. Материалы исследования…………………………………….
2.2. Методы исследования…………………………………………
3. Результаты и обсуждение………………………………….……
3.1. Определение показателей уровня интоксикации в
сыворотке крови практически здоровых людей……..
3.2. Определение показателей уровня интоксикации в
сыворотке крови больных сальмонеллезом………….…..
Список использованных источников……………………….…..
Выводы………………………………………………………………….
Приложения…………………………………………………………….
Введение
Успехи в борьбе с инфекционными заболеваниями в нашей стране общепризнанны. Вместе с тем в инфектологии еще остаются проблемы, имеющие серьезное социально-экономическое значение для всех стран мира. К их числу относятся острые кишечные инфекционные заболевания [1].
Сальмонеллез – группа острых кишечных инфекционных болезней, вызываемых бактериями рода Salmonella, характеризующихся значительным полиморфизмом клинического течения, частым наличием интоксикации, лихорадки, признаков поражения желудочно-кишечного тракта [2].
Крупные достижения отечественных и зарубежных исследователей, установивших патогенетическое значение нарушения биологической регуляции при острых кишечных инфекциях, дали новый импульс в изучении патогенеза сальмонеллеза [3].
Иммунная система представляет собой сложную многокомпонентную систему из быстроделящихся и покоящихся клеток. Она является высокочувствительной к воздействию токсинов бактерий. Это приводит к нарушению иммунорегуляторных процессов.
Наиболее информативными являются показатели состояний прооксидантно-антиоксидантного равновесия, которое при усилении действия на организм токсинов смещается в сторону активизации ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ.
ПОЛ – это фундаментальный универсальный молекулярный механизм, лежащий в основе устойчивости и адаптационных возможностей организма. В норме ПОЛ обеспечивает условие для жизненно важных функций клетки, в случае же интоксикации становится пусковым механизмом патобиохимических изменений в организме человека.
Целью моей дипломной работы является изучение биохимических показателей эндотоксикоза в динамике патологического процесса. В задачи исследования входило:
1. Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и активности каталазы в группе контроля, которую составили практически здоровые люди.
2. Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и активности каталазы у больных сальмонеллезом.
3. Исследование изменения изучаемых показателей у больных в зависимости от степени тяжести заболевания.
1.
Обзор литературы
1.1. Биохимическая характеристика интоксикации при сальмонеллезной инфекции
Сальмонеллезы принадлежат к числу инфекционных заболеваний, весьма широко распространенных на всех континентах мира. Возбудителем сальмонеллезов являются микроорганизмы, принадлежащие к роду Salmonella, семейства кишечных Enterobacteriaceae.
Сальмонеллы – это мелкие бактерии вытянутой формы с закругленными концами длиной от 1 до 3 и диаметром 0,5-0,8 нм [4].
Сальмонеллез встречается чаще у жителей городов, чем сел, что связывается с лучшей регистрацией заболеваемости, наличием множественных детских учреждений, широким употреблением пищевых полуфабрикатов. Заболевание отмечается круглый год, но максимальное число регистрируется в теплое время года, что объясняется благоприятными условиями размножения сальмонелл в пищевых продуктах и реализации инфекции [5].
Таблица 1.1.1.
Статистические данные больных сальмонеллезом г. Пензы.
Год
Количество больных
г. Пензы
На 100 тыс. населения, %
Кол-во больных Пензенской
области
На 100 тыс. населения, %
1996
187
34,9
362
23,1
1997
140
26,1
316
20,3
1998
230
43,0
448
28,8
В возникновении сальмонеллеза ведущую роль играют живые бактерии, гибель которых в организме больного сопровождается развитием эндотоксинемии. Принято выделять два вида токсичных продуктов жизнедеятельности микробов-экзотоксии и эндотоксии. К экзотоксинам отнесены токсичные продукты жизнедеятельности бактерий, активно (при жизни) секретируемые в окружающую среду, а к эндотоксинам – те ядовитые для макроорганизма продукты жизнедеятельности, которые освобождаются только при лизисе микробной клетки [6].
Кроме токсина палочка имеет ряд антигенов клеточной стенки. О-антиген расположен на поверхности микробной клетки и представляет собой фосфолипидно-полисахаридный комплекс, включающий 60 % полисахарида, 20-30 % липида и 3-4,5 % гексозамина. Н-антиген определяется жгутиками. Поверхностные антигены клеточной стенки провоцируют типоспецифический антительный ответ, а глубинные – видоспецифический [6,7].
При сальмонеллезе развитие и тяжесть симптомов обусловлены интоксикацией и обезвоживанием. По мнению А.Ф. Билибина интоксикация – явление сложное, сводящееся к изменению нервнорефлекторной деятельности и гуморальной регуляции с обменными сдвигами. К.В. Бунин в основу синдрома интоксикации ставит воздействие токсина на :
1) падение артериального давления, снижение сократительной способности миокарда;
2) гормональную регуляцию водно-солевого обмена с изменениями биосинтеза гормонов в коре надпочечников с угнетением процесса их метаболизма;
3) функцию почек (снижение клубочковой фильтрации, повышение канальцевой реабсорбции воды, снижение концентрации очищения мочевины) [8].
Сальмонеллезная интоксикация возникает как результат патологии первичного ответа на инфекционный агент вследствие значительных потерь воды и электролитов с рвотой и жидким стулом. По мере увеличения дефицита воды и электролитов на первый план выступают симптомы обезвоживания и поражения ЦНС. Если процесс прогрессирует, обезвоживание нарастает, появляются признаки недостаточности кровообращения, которые при интоксикации имеют клинику шока. Частая рвота и понос – первые признаки интоксикации [9].
Обязательным условием развития заболевания являются наличие большого количества возбудителей и их токсинов, массовое проникновение антигенов в кровь. Наибольшей токсичностью отличается липид А, вызывающий следующие основные реакции: активацию лейкоцитов и макрофагов, стимуляцию выброса эндогенного пирогена, антогониста глюкокортикоидов, интерферона, интерлейкинов, подавление тканевого дыхания, активацию системы комплемента, тромбоцитов, факторов свертывания крови другие [10,11], [рис. 1.1.1].
Главной причиной развития шока при сальмонеллезе считается не повреждающее действие самих микробов или их токсинов, а своеобразный ответ организма на них. Под токсико-инфекционным шоком следует понимать экстремальное состояние организма, наступающее в результате действия токсичных субстанций возбудителей, патогенных иммунных комплексов на органы и ткани организма, сопровождающееся острым нарушением метаболизма в них [12].
Схематическое изображение липополисахаридов
стенок микробов.
Рис. 1.1.1.
С.А. Степанов с помощью аспирационной биопсии обнаружил в тонкой кишке больных сальмонеллезом изменение эпителия, острое воспаление слизистой оболочки, нарушение микроциркуляции и сосудистой проницаемости. К.Х. Ходжаев в эксперименте на крысах показал, что сальмонеллезная инфекция вызывает нарушение процесов тканевого дыхания и фосфорилирования. Состояние поджелудочной железы изучено Белянской Т.А. В острый период болезни отмечено снижение ферментативной активности панкреатического сока – уровень трипсина был снижен в 71 % случаев, липазы в 55 %, амилазы – в 66 %.
Таким образом эндотоксин вызывает активацию синтеза, преимущественно протеолитических ферментов, задержку экструзии секретируемых проэнзимов, что приводит к секреции и поступлению ферментов в лимфатическое и кровеносное русло [13,14].
При сальмонеллезе развивается обезвоживание, обусловленное потерей внеклеточной жидкости, а при тяжелом течении заболевания и части клеточной. Дегидратация в большинстве случаев имеет изотонический характер, сочетаясь с развитием сгущения крови, дефицитом электролитов, метаболическим ацидозом в капиллярной и венозной крови [15], [рис. 1.1.2].
1.2. Молекулярные механизмы развития эндогенной
интоксикации при сальмонеллезе
Явления интоксикации вызывают заболевания, сопровождающиеся повышенным распадом тканей, усиленными процессами катаболизма, недостаточностью функции печени и почек, снижением процессов микроциркуляции [16].
В ответ на действие первичного патогена, которым являются эндотоксины, сальмонелл, в организме развиваются типовые каскадные реакции, что лежит в основе современной концепции СЭИ.
На Международном симпозиуме в Санкт-Петербурге (1994 г) было дано определение этого синдрома как клинического синдрома с проявлением симптомов интоксикации при патологических состояниях неоднородных по этиологии и обуславливающих накопление в тканях и биологических жидкостях организма продуктов патологического обмена веществ, метаболитов, деструкции клеточных и тканевых структур, разрушения белковых молекул [17,18].
Шано В.П. с соавторами подчеркивает, что токсическое влияние липополисахаридной субстанции эндотоксина проявляется комплексом нарушений, обусловленных повреждением как циркулирующих клеток в кровотоке, так и эндотелиоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, следствием чего является выброс в кровоток ряда биологически активных веществ – цитокинов, интерлейкинов. Главной точкой приложения эндотоксина являются эндотелиальные клетки, активация их приводит к высвобождению простациклина, выделению эластазы, токсических метаболитов кислорода, факторов активации тромбоцитов и комплемента с высвобождением терминального комплекса комплемента, брадикинина с последующим формированием синдрома повышенной проницаемости капилляров. Это приводит к тому, что в очаг воспаления начинают входить компоненты крови, прежде всего фибриноген и тромбоциты. Фибрин способствует агрегации тромбоцитов, полимеризации фибрина и – возникновению тромбов. Следствием тромбоза являются нарушения микроциркуляции с последующей гипоксией, что приводит к дальнейшим повреждениям клеток в очаге воспаления. Метаболическим результатом этого является изменение аэробного метаболизма клеток на анаэробный, повышенное продуцирование лактата и протонов, снижение показателей рН [19].
Среди тканевых (клеточных) медиаторов воспаления важное место занимают простагландины. Исходными продуктами для биосинтеза простагландинов являются ненасыщенные жирные кислоты: линолевая, арахидоновая, пентаноевая. Наибольшее значение имеет в организме арахидоновая кислота, которая содержится в фосфолипидах клеточных мембран.
Простагландины вызывают сильное диуретическое и натрийуретическое действие, оказывают разнообразное действие на желудочно-кишечный тракт. Они могут стимулировать и тормозить сокращение и секреторную активность тонкой кишки, тормозят секрецию соляной кислоты слизистой оболочки желудка. Простагландины вызывают секрецию воды и электролитов в просвет кишки, вызывая диарею, повышают концентрацию ц-АМФ в слизистой оболочке тонкой кишки, влияют на прочность и упругость эритроцитарной мембраны [20, 21, 22, 49].
1.3. Показатели уровня эндогенной интоксикации
организма при сальмонеллезе
Анализируя данные литературы за последние десятилетия, можно сказать, что основными показателями интоксикации при сальмонеллезе являются ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, ИТ, МСМ и активность каталазы. При развитии интоксикации на фоне сальмонеллеза происходит активный хемотаксис нейтрофиллов в очаг воспаления, где они поглощая и переваривая чужеродный агент, изменяют свою метаболическую активность, характеризующуюся усилением поглощения кислорода, повышенной утилизацией глюкозы и гиперпродукцией АФК () [23, 24].
Перекисное окисление является универсальным механизмом взаимодействия кислорода со многими органическими субстратами, в том числе с липидами. Внедрение кислорода в молекулы окисленного субстрата приводит к образованию реакционно-способных промежуточных продуктов – свободных радикалов, гидроперекисей, которые в дальнейшем вызывают повреждение других классов соединений – белков, нуклеиновых кислот, углеводов (рис. 1.3.1).
Метаболизм супероксидного радикала в норме
и при патологии (Владимиров Ю.Я., 1998)
Рис. 1.3.1.
Накопленные к настоящему времени данные литературы позволяют сделать вывод о том, что свободнорадикальное окисление липидов при сальмонеллезной инфекции играет определенную патогенетическую роль [25, 50].
Установлено, что при развитии ПОЛ в биомембранах понижается содержание легкоокисляемых полиненасыщенных жирных кислот и изменяются физико-химические свойства: микровязкость, текучесть, мембранный потенциал, полярность внутренних областей мембран. Таким образом, изменяются транспортные свойства мембраны и активность ферментов [26].
Регуляция свободнорадикального окисления обеспечивается в клетке системой антиоксидантной защиты. Так, накапливающаяся в процессе ПОЛ перекись водорода обезвреживается с помощью каталазы, присутствующей во всех тканях организма. Каталаза (КФ 1.11.1.6.) представляет собой гемсодержащий фермент с молекулярной массой около 250000 Д, локализованный в пероксисомах клеток [27].
Митохондриальная каталаза участвует в оксидазном пути окисления, сопровождающемся запасанием энергии в виде АТФ. Блокирование транспорта электронов в дыхательной цепи приводит к стимуляции пероксисомального окисления. При потологиях, связанных с нарушением энергетических процессов, каталаза пероксисом может выходить из них и участвовать в окислении на мембранах эндоплазматического ретикулума [28, 53].
В работе Л.Б. Оконенко с соавторами о состоянии антиоксидантной системы судили по активности СОД, глутатионпероксидазы и каталазы, анализ данных выявил дефицит антиоксидантов [29, 30].
При инфекционном токсикозе в мембранах эритроцитов резко снижается содержание общих фосфолипидов, но увеличивается количество НЭЖК и лизофосфотидилхолина, что косвенно указывает на повышение активности фосфолилаз, которые избирательно разрушают липиды мембран. Холестерин подвергается как активному, так и пассивному обмену в мембранах эритроцитов [29]. Фермент лецитинхолестеролацил трансфераза превращает эфиры холестерина в свободный холестерин и тем самым регулирует уровень свободного холестерина в плазме, что способствует проникновению его в мембраны. Следовательно, инактивация этого фермента в результате гипоксии при эндотоксикозе ведет к повышению уровня эфиров холестерина в мембранах эритроцитов [31,32].
Наряду с уровнем МДА, активности каталазы и уровня холестерина для диагностики заболевания и его прогноза имеют значение и другие неспецифические показатели – ЦИК, Ит, МСМ.
Синтезирующиеся при формировании иммунитета специфические антитела обладают способностью взаимодействовать с антигенами возбудителей и тем самым вызывать нейтрализацию патогенных микробов и их токсинов. Эта реакция сопровождается образованием иммунных комплексов антиген – антитело [33, 34, 54, 55]. При патологических состояниях образование ИК выходит из под контроля, в результате чего развивается та или иная болезнь ИК [рис. 1.3.2.].
Патогенетические механизмы болезней иммунных
комплексов (Сура В.В., 1987)
Рис. 1.3.2.
В результате развития эндотоксемии при сальмонеллезе организм длительное время контактирует с избытком АГ как экзогенного (компоненты микробных клеток), так и эндогенного (компоненты разрушенных клеток самого организма) происхождения. Вместе с тем наблюдается угнетение системы комплемента, ответственного за лизис микробных клеток. В этих условиях значительного избытка АГ и недостаточности выработки АТ может привести к образованию ИК, которые способны откладываться в определенных тканях и вызывать острые воспалительные реакции. При значительных отложениях наблюдаются функциональные и морфологические повреждения органов и тканей [35].
Связываясь с клеточной мембраной ЦИК вызывают выделение в окружающую среду протеолитических ферментов и основных пептидов. Эти вещества повреждают протеогликановые компоненты тканей, действуют на базальную мембрану и вызывают некроз эндотелиальных клеток [36].
ЦИК наряду с продуктами ПОЛ вызывают нарушение проницаемости мембран, вплоть до их разрыва, что в конечном итоге может привести к гибели клетки. В результате появляются различные вещества пентидной природы. Из них наибольший интерес представляют молекулы средней массы.
Являясь олигопептидами с молекулярной массой 300-5000 Дальтон, они расцениваются как универсальный критерий эндогенной интоксикации и влияют на ее уровень и прогноз [37, 38].
МСМ образуются в организме под воздействием повреждающих эндогенных или экзогенных факторов различного генеза, являются промежуточными продуктами протеолиза. [39, 57].
Пристальное внимание исследователей к МСМ объясняется высокой биологической активностью их отдельных фракций, которые ингибируют гликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, синтез гемоглабина, нуклеиновых кислот, мембранный транспорт, дагоцитов, эритропоэз, микроциркуляцию, обладают иммунодепрессивным, цитотоксическим, нейро- и психотропным свойствами. Сейчас, квалификационная оценка степени тяжести состояния больных при сальмонеллезе немыслима без определения МСМ [40].
Установлено, что значительная часть циркулирующих в крови СМ не только растворена в плазме крови, но и связана с альбумином.
Человеческий сывороточный альбулин (ЧСА) – важнейший транспортный белок, осуществляющий перенос эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в плазме крови, межклеточной жидкости, в лимфе.
Универсальность транспортной функции ЧСА обеспечивается его уникальной способностью связывать лиганды различной химической природы. Интенсивная лигандная нагрузка молекул альбулина приводит к изменению их структуры и связывающей способности. Такие модификационные формы ЧСА обнаруживаются при патологии [41].
О величине токсического действия вредных веществ можно судить по ЭКА, которая снижается после того, как токсические вещества займут центры связывания в молекуле альбулина, что приводит к снижению детоксикационных свойств организма. Изучение свойств альбулина является важным с точки зрения как диагностики, так и лечения [42].
2.
Материалы и методы исследований
2.1. Материал исследований
Уровень интоксикации оценивался по изменениям в крови больных эффективной и общей концентраций сывороточного альбулина, малонового диальдегида, как одного из продуктов ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, МСМ и активности каталазы.
Для всех исследований бралась сыворотка крови. Исследовано 30 больных сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет. Для контроля набиралась группа 51 человека разного пола в возрасте от 20 до 46 лет.
Кровь бралась из локтевой вены, преимущественно натощак в количестве не менее 5 мл. Центрифугируем 1500 об/мин 10 минут. Для выполнения анализов сыворотки необходимо использовать сразу или заморозить и хранить при t=-20С.
2.2. Методы исследований
2.2.1. Определение МДА с тиобарбитуровой кислотой
(Конюхова В.С., 1989)
Об изменении интенсивности ПОЛ судим по изменению уровня вторичного продукта ПОЛ – малонового диальдегида.
Метод основан на том, что при высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-ТБК, образуя окрашенный розовый триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 535 им.
Ход работы: К 0,2 мл сыворотки крови добавить 0,2 мл дистиллированной воды, 1 мл 0,6 % ТБК в ледяной уксусной кислоте. Кипятить 30 минут, охладить и добавить 1 мл 5№ КОН и 2 мл изопропанола. Центрифугируют при 6000 об/мин 20 минут. Колориметрируют при 535 нм и 580 нм против контроля, содержащего вместо плазмы воду.
Расчет: (мкМоль/л), где Е – оптическое поглащение изопропилового экстракта; 106 – коэффициент пересчета оптической плотности.
Пример расчета: больной Максимов С., 19 лет
концентрация МДА = (мкМоль/л).
2.2.2. Определение активности каталазы
(Королюк М.А., 1988)
Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.
Ход определения: Реакция запускается добавлением 0,1 мл сыворотки крови к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.
Расчет: (мкат/л), где
Е – активность каталазы в мкат/л;
А – оптическая плотность холостой и опытной проб;
V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;
t – время инкубации, 600 сек;
К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный .
За единицу активности каталазы принимают то количество фермента, которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за 1 секунду при заданных условиях. Расчет активности каталазы ведут на 1 л сыворотки крови.
Пример расчета: больной Крайнов Т.В., 31 год.
2.2.3. Определение общего холестерина в сыворотке крови ферментативным методом «Фотокол»
(Творогова М.Г., 1995)
Определение основано на сопряженных реакциях, которые катализирует холестеринэстераза, холесериноксидаза и пероксидаза:
Эфиры холестерина холестерин + Ж.К.;
Холестерин + О2 холестинон + Н2О2;
Н2О2 + хромогены Н2О + окрашенный продукт.
Концентрация образующегося в ходе реакции окрашенного продукта пропорциональна концентрации холестерина в пробе.
Ход определения: Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при t = 37oС. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и инкубировать 20 минут при t = 37oС. Окрашенные пробы фотометрировать при 500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм или 10 мм относительно холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной температуре.
Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:
ммоль/л, где
ЕОП и ЕК – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.
Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.
2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов
в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)
Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в 3,75 % ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.
Реактивы:
1) 0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры растворить в 1 л дистиллированной воды)
2) 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.
Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить 0,6 мл реактива №1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2 пробирки. В I добавить 2,7 мл раствора №1 (контроль). Во II добавить 2,7 мл раствора №2 (опыт). Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. На спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую плотность в кюветах при 450 нм.
Расчет: Высчитывают разность показателей оптической плотности, результат умножают на 1000 и получают количество ИК в 100 мл сыворотки. Ответ выражают в единицах оптической плотности. - количество ЦИК в 100 мл сыворотки.
Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.
Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.
Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:
2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)
Метод основан на осаждении белков из исследуемой жидкости 10 % раствором ТХУ с последующем центрифугированием и определением абсорбции света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.
Ход работы: Сыворотку крови обрабатывают 10 % раствором ТХУ. В качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в 30 раз разведенный дистиллированной водой. Оптическая плотность его против воды составляет 0,123?0,012 усл. ед. на волне 254 нм при 23-25С. Центрифигируем 3000 об/мин в течение 30 минут. К 0,5 мл надосадочной жидкости +4,5 мл дистиллированной воды. Измерение проводим на спектрофотометре в УФ свете при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине волны 254 нм для определения нуклеотидов. Уровень МСМ выражают в единицах, количественно равных показателям экстинции.
2.2.6. Определение показателей «эффективная концентрация
альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке крови человека флуоресцентным методом
(Миллер Ю.И., 1994).
Принцип метода:
Метод основан на специфическом взаимодействии флуоресцентных органических соединений с альбумином в сыворотке крови. В зависимости от условий этого взаимодействия интенсивность флуоресценции красителя из альбумина отражает различные свойства белка. Индекс ЭКА/ОКА не зависит от числа молекул альбумина в пробе и характеризует физико-химические свойства молекулы альбумина.
Состав набора:
Реактив I (4 ампулы по 5 мл). Предназначен для приготовления раствора используемого при разбавлении сыворотки крови. Он содержит антикоагулянт ЭДТА.
Реактив II (4 ампулы по 0,7 мл). Основным компонентом является специальное флуоресцирующее соединение, интенсивность флуоресценции которого в сыворотке крови пропорциональна концентрации сывороточного альбумина.
Реактив III (4 ампулы по 0,7 мл). Взаимодействие реактивов №2 и №3 с сывороткой позволяет определить ОКА.
Определение показателя ЭКА:
К 2,0 мл надосадочной жидкости добавить 0,025 мл реактива 2. Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 420 нм и длине волны испускания 515 нм.
Определение показателя ОКА:
В ту же пробу добавить 0,025 мл реактива 3. Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции. Нормальные величины показателя ЭКА лежат в интервале нормальных значений ОКА от 40 г/л – 55 г/л.
Подготовка образцов крови к измерениям:
Буферный раствор: Содержимое ампулы с реактивом 1 перенести в 100 мл дистиллированной воды. Перемешать. 0,025 мл сыворотки крови добавить в пробирку, содержащую 5 мл раствора для разбавления крови. Для анализа берут жидкость 2,0 мл полученного образца.
Используют специализированный анализатор АКЛ-0,1.
3. Результаты исследования и их обсуждение
3.1. Определение показателей уровня интоксикации в сыворотке крови практически здоровых людей
Нами было произведено исследование биохимических показателей – МДА, активность каталазы, уровень холестерина, ЦИК, МСМ, Ит в сыворотке крови 51 донора в возрасте от 20 до 46 лет. Сыворотка крови доноров была получена на ОСПК (областная станция переливания крови) г. Пензы.
Полученные результаты биохимических анализов были подвергнуты статистической обработке, согласно методам и приемам статистического анализа.
По данным комитета экспертов Международной федерации клинической химии по референтным величинам рекомендуется верхняя и нижняя границы нормы на уровне М?1,96?, состояние предболезни М?2?, состояние острой формы М?3?.
Об уровне процессов ПОЛ судили по концентрации вторичного продукта МДА. Содержание количества МДА составляет 3,61?0,07 мкМоль/л. Это значение близко к данным, найденным в литературе (табл. 3.1.1). У 48 человек значение содержания МДА входит в границы М?1,96?. У 3 человек (5 %) содержание МДА соответствует значению М?2?, что соответствует состоянию предболезни.
Активность каталазы у практически здоровых людей составила 16,7?0,15 мкат/л (табл. 3.1.1). При исследовании активности каталазы в группе доноров отклонений за пределы М?1,96? мы не наблюдали.
Уровень холестерина, определяемый нами у практически здоровых людей составил 4,45?0,68 ммоль/л (табл. 3.3.1.), показатели уложились в границу референтной величины М?1,96?.
Содержание ЦИК, определяемое нами в сыворотке крови практически здоровых людей составило 52,62?3,52 усл. ед. (табл. 3.1.1). 94 % людей по показателям ЦИК входит в границы нормы, а 6% находятся в состоянии предболезни.
Уровень МСМ у обследованных доноров в среднем составил 0,280?0,01 усл. ед. Это значение близко к данным, найденным в литературе (табл. 3.1.1). При исследовании МСМ отклонений за пределы М?1,96? мы не наблюдаем.
У практически здоровых людей определена детоксикационная нагрузка сывороточного альбумина, т.е. определение общей и эффективной концентрации альбумина. Токсичность по альбумину составляет 0,13?0,01 усл. ед. (табл. 3.1.1). Все значения токсичности по альбумину вошли в границы М?1,96?.
Полученные нами данные не имели существенных отличий от значений этих показателей, имеющихся в литературе в сравнении с приложением 2.
Таблица 3.1.1.
Содержание биохимических показателей в сыворотке крови практически здоровых людей
Группа
обследованных
n
МДА
мкМоль/л
Активность
каталазы
мкат/л
ЦИК
усл. ед.
МСМ
усл. ед.
Ит
усл. ед.
Холестерин
ммоль/л
Практически
здоровые
51
3,61?0,07
16,7?0,15
52,62?3,52
0,28?0,01
0,13?0,01
4,45?0,68
3.2. Определение показателей уровня интоксикации
в сыворотке крови больных сальмонеллезом
Сыворотка крови больных исследовалась на базе центра госсанэпиднадзора г. Пензы. Исследования биохимических показателей велись в острую фазу заболевания и в период ранней реконвалесценции. Обследовано нами 30 больных сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет, с целью установления показателей, характеризующих эндотоксикоз: перекисное окисление липидов, уровень холестерина, Ит по сывороточному альбумину, циркулирующих иммунных комплексов, молекул средней массы и активности каталазы. Причем биохимические показатели крови в разгар заболевания отличались от показателей в период ранней реконвалесценции.
Таблица 3.2.1.
Биохимические показатели сыворотки крови
у больных сальмонеллезом
Группа
обследованных
МДА
мкМоль/л
Активность
каталазы
мКат/л
Ит
усл. ед.
ЦИК
усл. ед.
МСМ
усл. ед.
Холестерин ммоль/л
Контроль, n=51 (практически
здоровые)
3,61?0,07
16,7?0,15
0,13?0,01
52,62?3,52
0.280?0,01
4,45?0,68
Больные (острый период) n=30
7,19?0,2
13,09?0.16
0,29?0,01
100,63?4,04
0,550?0,02
6,54?0,07
Больные (ранняя
реконвалесценция) n=30
3,87?0,15
15,84?0,19
0,15?0,01
68,9?2,8
0,310?0,02
4,65?0,7
р?0,001
р?0,01
р?0,001
р?0,001
р?0,05
р?0,01
Так, в ходе исследования выявлено достоверное увеличение количества МДА в сыворотке крови больных сальмонеллезом на 99 % по отношению к контролю, т.е. возрастает в 2 раза. Данные наших исследований подтверждаются сведениями Л.Б. Оконенко, Л.Д. Мартыненко и другими. По данным этих авторов концентрация МДА при сальмонеллезе возрастает в 2-2,5 раза.
Как видно из таблицы (табл. 3.2.1), у больных наблюдается интенсификация ПОЛ.
Под воздействием сальмонеллезного токсина происходит нарушение липидных бислоев клеточных и субклеточных мембран. Накопление в крови первичных и вторичных продуктов ПОЛ идет не в силу количественных изменений в содержании фосфолипидов плазмы крови, а вследствие интенсификации их свободнорадикального окисления. Результатом инициации ПОЛ становится образование критических концентраций продуктов ПОЛ, которые токсичны для организма. Известно, что повышение ПОЛ может приводить к нарушению проницаемости мембран с последующей инактивацией мембранно-ассоциированных ферментных систем, выходом лизосомальных гидролаз в цитозоль, что вызывает повреждение ДНК т другие существенные изменения в структуре и функциональном состоянии клетки [29, 43, 51, 52].
Установлено, что при ряде инфекционных заболеваний развивается антиоксидантная недостаточность. Одновременно снижается актиность ферментов антиоксидантной защиты, в частности каталазы [44].
По нашим наблюдениям, активность каталазы снизилась на 22 % в острый период заболевания по отношению к контролю. В период ранней реконвалесценции показатель активности каталазы приближается к контролю (табл. 3.2.1).
Л.Б. Оконенко, Л.И. Волкова в своих работах отмечает угнетение каталазной активности. В острый период заболевания происходит резкое сокращение антиоксидантной обеспеченности организма [26, 29].
А.С. Волков указывает на то, что в процессе эндотоксикации метаболические расстройства приводят к гиперлипидемии. Это подтверждается данными наших наблюдений. Так, уровень холестерина в сыворотке крови больных сальмонеллезом в среднем составил 6,54?0,07 ммоль/л, что на 46,9% больше контроля (табл. 3.2.1).
Таким образом, гиперхолестеринемия характеризует патологию обмена липидов и липопротеидов [32,45].
В период ранней реконвалесуценции уровень холестерина приближается к контролю [рис. 3.2.1].
Процентное соотношение показателей липидного обмена при эндотоксикозе, вызванном сальмонеллезной инфекцией
Рис. 3.2.1.
Анализируя результаты проведенных исследований, мы установили, что содержание ЦИК в плазме крови больных сальмонеллезом на 91 % больше, чем в контроле [рис. 3.2.2]. Полученные данные согласуются с выводами исследования И.А. Ильинского, Т.В. Лукинской и других. Повышенное содержание ЦИК говорит о снижении антителообразования в присутствии избытка антигенов. В подобной ситуации ЦИК индуцирует острое иммунное воспаление, сопровождающееся повреждением эндотелия сосудов и почечных клубочков, активацией кининовой системы, что ведет к более серьезным метаболическим нарушениям [46, 47, 48].
Как правило, повышение уровня ЦИК обнаруживается уже в начальный период болезни, на этом же уровне содержание их остается и в острую фазу. Только в стадии реконвалесценции наблюдается понижение показателей [табл. 3.2.1].
Процентное соотношение показателей эндотоксикоза (ЦИК, МСМ) в сыворотке больных относительно контроля
Рис. 3.2.2.
При воспалении воздействие протеиназ на протеогликановые комплексы тканей приводит к образованию пула токсических веществ со среднемолекулярной массой (МСМ).
У обследованных нами больных сальмонеллезом уровень МСМ на 96 % выше по сравнению с контролем (рис. 3.2.2). По нашим данным содержание МСМ при сальмонеллезе повысилось в 1,9 раза, что согласуется с данными исследований Б.С. Нагаева и М.И. Габриловича. В наших исследованиях уровень МСМ повышается в разгар заболевания [т