Согласно Львову, «организм - некая независимая единица интегрированных и взаимосвязанных структур и функций». У простейших, то есть у одноклеточных именно клетка является независимой единицей,иными словами, организмом. И клеточные организмы - митохондрии, хромосомы и хлоропласты - это не организмы, ибо они не являются независимыми. Получается, что если следовать определению, данным Львовым, вирусы не являются организмами, так как не обладают независимостью: для выращивания и репликации генетического материала нужна живая клетка.
В то же время,у многоклеточных видов независимо от того, животные или растения, отдельные линии клеток не могут эволюционировать независимо друг от друга; следовательно, их клетки не являются организмами. Для того чтобы изменение было эволюционно значимым, оно должно быть передано новому поколению индивидуумов. В соответствии с этим рассуждением организм представляет собой элементарную единицу некоторого непрерывного ряда со своей индивидуальной эволюционной историей
Вирус обретает относительно независимую эволюционную историю благодаря его способности к адаптации в направлении, ведущим к приобретению им способности передаваться от хозяина к хозяину. Он может пережить клетку или организм, в которых паразитирует; фактически вирус часто «эксплуатирует» клетку. Один вирус может встречаться в разных видах, родах и типах и также один и тот же вирус может передаваться от растений насекомым и размножаться в клетках тех и других. Вирус, обладающий соответствующей приспособляемостью, может использовать разнообразные эволюционные ниши. Таким образом, вирус, конечно, обладает большей независимостью, чем любая клеточная органелла. То есть, в эволюционном плане вирус в большей степени организм, чем хромосома или даже клетка многоклеточного животного, хотя функционально он значительно менее независим, чем любая такая клетка.
И в то же время, можно рассматривать данную проблему с точки зрения другого определения: материал является живым если, будучи изолированным, он сохраняет свою специфическую конфигурацию так, что эта конфигурацияможет быть реинтегрирована, то есть вновь включена в цикл, в котором участвует генетическое вещество: это отождествляет жизнь с наличием независимого специфическогосамореплицирующегосяспособа организации. Специфическая последовательность оснований нуклеиновой кислоты того или иного гена может копироваться; ген - это некая часть запасов информации, которой располагаетживой организм. В качестве теста на живое данное выше определение предлагает воспроизведение в различных клеточных линиях и в ряде поколей организмов. Вирус, согласно этому тесту, живой точно так же, как и любой другой фрагмент генетического материала, что его можно извлечьиз клетки, вновьввести в живую клетку и что при этом он будет копироваться в ней и станет хотя бы на некоторое время часть ее наследственного аппарата. При этом передача вирусного генома составляет основной смысл существования этих форм - результат их специализации в процессе отбора. Поэтому специализированностьвирусов как переносчиков нуклеиновых кислот дает возможность считать вирусы «более живыми», чем какие либо фрагментыгенетического материала, и «более организмами», чем любые клеточные органеллы, включая хромосомы и гены.
Строгие постулаты Коха
Каковы же те основные положения, сформулированные Робертом Кохом (1843-1910), которых долженпридерживатьсямикробиолог при каждом обнаружениинеизвестного возбудителя ? Что может служить доказательством, что именно он является причиной данного инфекционного заболевания ? Вот эти три критерия:
Неоднократное получение чистой культуры возбудителя, взятого из организма больного.
Возникновение точно такого же или сходного заболевания (как по характеру течения, так и по вызываемым им патологическим изменениям) при инфицировании здорового организма культурой предполагаемого возбудителя.
Появление в организме человека или животного после их заражения данным возбудителем всегда одних и тех же специфических защитныхвеществ. При контактеиммунной сыворотки крови свозбудителем из культуры последний должен терять своипатогенные свойства.
Для современной вирусологии характерно бурное развитие иширокое применение самыхразличных методик - как биологических (включая генетические), так и физико-химических.. Онииспользуются при установлении новых, до сих пор еще неизвестных вирусов, и при изучениибиологических свойств и строения уже обнаруженных видов.
Фундаментальныетеоретические исследования дают обычноважные сведения, которые используются в медицине, в области диагностики или приглубоком анализе процессов вирусной инфекции. Введение новыхдейственных методов вирусологии связано, как правило, с выдающимисяоткрытиями.
Так например, метод выращивания вирусов в развивающемся курином эмбрионе, впервые примененный А. М. Вудрофом и Е. Дж. Гудпэсчуром в 1931 году, был с исключительным успехом использован при изучении вируса гриппа.
Прогресс физико-химических методов, в частности метода центрифугирования, привел в 1935 году квозможности кристалмуации вируса табачной мозаики (ВТМ) из сока больных растений, а впоследствии и к установлению входящих в его состав белков. Этим был дан первый толчок к изучению строения и биохимии вирусов.
В 1939 году А. В. Арден и Г. Руска впервые применили для изучения вирусов электронный микроскоп. Введение этого аппарата в практику означало исторический перелом в вирусологических исследованиях, поскольку появилась возможность увидеть - хотя в те годы еще и недостаточно четко - отдельные частицы вируса, вирионы.
В 1941 году Г.Херст установил, что вирус гриппа при известных условиях вызывает агглютинацию (склеивание и выпадение в осадок) красных кровяных телец (эритроцитов). Этим былаположена основа для изучения взаимоотношений между поверхностными структурами вируса и эритроцитов, а также для разработки одного из наиболее эффективных методов диагностики.
Коренной перелом и вирусологических исследованиях произошел в1949 г., когда Дж. Эндерсу, Т. Уэллеру и Ф. Роббинсу удалось размножить вирус полиомиелита в клетках кожи и мышц человеческого зародыша. Они добились разрастания кусочков ткани наискусственнойпитательной среде. Клеточные (тканевые) культуры были инфицированы вирусом полиомиелита, который до этого изучали исключительно на обезьянах и лишь очень редко на особом виде крыс.
Вирус в человеческих клетках, выращенных внематеринского организма, хорошо размножался и вызывалхарактерные патологические изменения. Метод культуры клеток (длительное сохранение и выращивание в искусственных питательных средах клеток, выделенных из организма человека и животных) был впоследствииусовершенствован и упрощен многими исследователями и стал, наконец, одним из наиболее важных ирезультативных для культивирования вирусов. Благодаря этому более доступному и дешевому методу появилась возможность получать вирусы в относительно чистом виде, чего нельзя было достичь в суспензиях из органов погибших животных. Введение нового метода означало несомненный прогресс не только в диагностике вирусных заболеваний, но и в получении прививочных вакцин. Он дал также неплохие результаты и в биологических и биохимических исследованиях вирусов.
В 1956 году удалось показать, чтоносителем инфекционности вируса являетсясодержащаяся внем нуклеиновая кислота. А в1957 году А.Айзекс и Дж. Линдеман открыли интерферон, которыйпозволил объяснить многие биологические явления, наблюдаемые вотношениях между вирусом и клеткой - хозяином или организмом - хозяином.
С. Бреннер и Д. Хорн ввели втехнику электронной микроскопии метод негативногоконтрастного окрашивания, сделавший возможным изучение тонкого строения вирусов, в частности их структурных элементов (субъединиц).
В 1964 году уже упоминавшийся нами ранее американский вирусолог Гайдузек с сотрудниками доказалинфекционный характер ряда хронических заболеванийцентральной нервной системы человека и животных. Он изучал недавно обнаруженные своеобразные вирусы, лишь в некоторых чертах схожие сранее известными.
В то же время американскийгенетик Барух Бламберг обнаруживает (в процессе генетических исследований белков крови) антигенсывороточного гепатита (австралийский антиген), вещество, идентифицируемое при помощисерологических тестов. Этому антигену суждено было сыгратьбольшую роль в вирусологических исследованиях гепатита.
В последние годы одним из крупнейших успехов вирусологии можно считать раскрытие некоторыхмолекулярно-биологических механизмов превращения нормальныхклеток в опухолевые. Не меньшие успехи были достигнуты и в области изучения строения вирусов и их генетики.
Инфекционная единица
Наименьшее количество вируса, способное в данном опыте вызвать инфекцию, называетсяинфекционной единицей.
Для ее определения применяются обычно два метода. Первый основан на определении 50 %-ной летальной дозы, которая обозначается LD 50 (от лат. Letatis - смертельная, dosis - доза). Второй метод устанавливает число инфекционных единиц по числу бляшек, образовавшихся в культуре клеток.
Что, в сущности, представляет собой величина LD 50 и как она определяется? Исследуемый вирусный материал разводится в соответствиисоснижающимися степенями концентрации, скажем кратными десяти: 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. Каждым из растворов с указанными концентрациями вируса инфицируют группуживотных (десять индивидуумов) или культуру клеток в пробирках. Потом наблюдают гибель животных или изменения, происшедшие вкультуре под влиянием вируса.Статистическим методом определяется степень концентрации, способная умертвить 50 % животных из числа зараженных исходным материалом. При использовании культуры клеток следует найти такую дозу вируса, которая производит губительное действие на 50 % инфицированных ею культур. В этом случае употребляется сокращение ЦПД 50 (цитопатическая доза). Иначе говоря, речь идет о такой дозе вируса, которая вызывает повреждение или гибель половины инфицированных ею культур.
Методом бляшек нельзяполучитьстатистические данные, но можно установить фактическое число единиц вируса в материале, дающем бляшки в культуре клеток. В идеальном случаетакая единица отвечает однойфункционально полноценной частице.
Титрование
Индуцируемаявирусом реакция может происходить по типу «все или ничего» (то есть наличие или отсутствие инфекции), а может быть выражена количественно, например продолжительностью времени, необходимого проявления инфекции, или числом поражений в слое чувствительных клеток. Количественное определение вирусной активности называется титрованием. Титр исходной вирусной суспензии выражается числом инфекционных единиц, приходящихся на единицу объема. Инфекционные нуклеиновые кислоты, независимо от того выделены ли они из фагов или из вирусов животных или растений, как правило, обладают значительно меньшим инфекционным титром, чем исходный вирус (то есть отношение числа содержащихся в препарате молекул нуклеиновой кислоты к числу инфекционных единиц значительно больше, чемсоответствующие величины для вирионов, из которых эти нуклеиновые кислоты были выделены). Однако и при титровании свободной нуклеиновой кислоты и при титровании вирионов вероятность нахождения в пробе среднего числа частиц выражается одной формулой. Отсюда следует,что вирусную инфекцию может вызвать также и одна молекула вирусной нуклеиновой кислоты. Как правило, инфекционными являются только интактные вирусныеДНК и РНК. Исключение наблюдается при множественном заражении клеток молекулами нуклеиновой кислоты, содержащими неполным геномвируса.
Резюмируясказанное, можно прийти к выводу, что титр вирусной суспензии, выраженный числом инфекционных единиц,содержащихся в единице объема, как правило, соответствует числу вирионов (или числу молекул вирусной нуклеиновой кислоты), способных при условиях данного опыта вызвать инфекцию.
Утрата инфекционности
Как правило, чувствительность вирионов данного вируса к действию тех или иных инактивирующих веществ определяется специфическими свойствами его белков, вследствие чегометоды инактивации инфекционности, разработанные дляданного конкретноговируса,эффективны лишь в отношении близкородственных ему вирусов. Исключение составляет чувствительность вирусов к рентгеновским лучам, которая зависит от типа нуклеиновой кислоты вирионов и ее количества. В основе этой закономерности лежит тот факт, что действие рентгеновских лучей приводит к разрыву молекул нуклеиновой кислоты, и даже одного такого разрыва часто бывает достаточно для утраты инфекционного вируса. Результаты экспериментов показывают, что мелкие вирусы инактивируются рентгеновскими лучами значительно эффективнее, так как для них характерна большая величина отношения содержания в вирионе нуклеиновой кислоты к содержанию в нем белка, чем для крупных вирионов, более богатых белком.
Серологические методы
В целях определения вида данного вируса при изучении защитных процессов ворганизме больного человека или зараженного животного применяются серологические методы. Серология (от лат. Serum - сыворотка, жидкаясоставная часть крови) - это раздел иммунологии, изучающий реакцииантигена специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие вируса. Онисвязываются с определеннымиантигенными веществами, находящимися на поверхностивирусных частиц. В результате связывания молекулантител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патогенные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке или определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации вируса. Ее можнопроводить как на животных, так ина культуре клеток.
Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобынейтрализовать вирус, не дать ему проявитьцитопатическое действие, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек.
Для обнаружения антител используется методторможения гемагглютинации (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания комплемента. Из методов, применяемых в вирусологии для различных исследовательских целей, можно еще упомянуть методы, при помощи которых вирусологический материал подготавливается для физических и химических анализов, которые облегчают изучение тонкого строения и состава вирусов. Эти анализы требуют большого количествасовершенно чистого вируса. Очистка вируса - процесс, при котором из суспензии свирусом устраняются всепосторонние, загрязняющие ее частицы. В основном это кусочки и «обломки»клеток - хозяев. Одновременно с очисткой происходит обычно сгущение суспензии, повышение концентрации вируса. Так получается исходный материал для многих исследований.
Из отдельных методов очисткиупомянем лишь наиболее эффективный - метод ультрацентрифугирования,который дает препараты вируса очень высокой концентрации.
Опишем вкратце процедуруполучения и очистки вирусной суспензии. Процесс этот начинается сискусственного введения вируса в мозг подопытного животного. По прошествии нескольких дней вирус размножится в ткани мозга. При этом обнаружатсяхарактерные нарушения функцийнервной системы «хозяина», и у животного выявятся признаки заболевания. Когда симптомы достигнут наибольшего развития, зверька умерщвляют, а его мозг, втканях которого содержатся большие количества вируса, извлекают в стерильных условиях из черепаживотного. Затем из мозга готовится, скажем ,10 %-ная суспензия. Кроме вирионов она содержит еще и большое количество кусочков нервной ткани, остатки кровеносных сосудов, кровяные тельца и другие биологические компоненты. Кусочки ткани и другие крупные частицы устраняются первым центрифугированием со скоростью 5000-10000 оборотов в минуту. Оно продолжается около получаса. Жидкость над осадком (суперкатакт) осторожно сливаютв специальные пробирки для центрифугирования, сделанные из пластмассы или нержавеющей стали, поскольку стекло не выдерживает давление, которое развивается привысокоскоростном центрифугировании. А осадок обезвреживают дезинфицирующими средствами. Слитый «супернатант» обрабатывается затем уже в ультрацентрифуге.
Для седиментации мельчайших вирусов необходимо многочасовое ультрацентрифугирование, причем полученный осадок часто бывает не больше булавочной головки. Но ипосле такой обработки мы имеем не совсем чистый вирусный материал, в нем еще содержатся чужеродные примеси. Для тонких анализов этот осадок надо несколько раз обработать различнымиреактивами и повторитьультрацентрифугирование. Только тогда можно получитьконцентрированную суспензию вируса высокой чистоты, которая требуется для точных и достоверных биохимических, кристаллографических анализов или длянаблюдений в электронно-оптических приборах.
В распоряжении вирусологов вообще много различных технических приспособлений, как , например ,центрифугирование по градиентам концентрации, когда вирионы разделяются по степеням концентрации или по форме. Другой прибор, представляющий в наше времястандартное оборудование почти каждой научно-исследовательскойвирусологической лаборатории - электронный микроскоп. Это дорогостоящий, большой и сложный аппарат.
Для получения изображения вирусов существует много различных методов, и все они прошли свои этапы развития. Чтобыобнаружить вирионы в клетках, в настоящее время пользуются методомультратонких срезовФиксированный материал, залитый эпоксидной смолой, разрезаетсятончайшим стеклянным или алмазным ножом. При помощи точных ультрамикротомоводну клетку можно разрезать более чем на тысячу тонких срезов. Полученные таким образом срезы обрабатываются затем специальными химикалиями, что обеспечивает лучшую их видимость.
Для наблюдения тонкого строения отдельных вирионов применяется метод негативного контрастирования (окрашивания), внедрение которого значительно повысило качественный уровень электронногомикроскопирования. Вирусные частицы при этом осторожно смешиваются сраствором фосфовольфрамовойкислоты, дающей осадок, не пропускающий электронные лучи. В результате вирионы предстают в виде своих совершенно точных отпечатков, по которым можно изучать самые тонкие детали их поверхностей. При методепозитивногоокрашивания (или «металлизирования» препарата) применяются такие вещества, которые способны выборочно прилипать к поверхностивирионов (например, специфические антитела, меченные ферритином, содержащим в своей молекуле железо и потому хорошоразличимые в электронном микроскопе).
Общие методы изучениявирусов
О присутствии вируса в организме как приспонтанном заболевании, так и при экспериментальном заражении хозяина судят по появлению тех или иных патологическихсимптомов. Всякий раз, когда возникает подозрение о присутствии вируса визучаемом объекте, приходится подбирать определенный комплекс условий - подходящий организм исоответствующий способ заражения, - при котором вирус вызывает взараженном организмераспознаваемые изменения. Так что вирусологам приходится затрачивать большиеусилия на разработку методовполучения экспериментальных инфекций.
Как известно, для доказательства того ,что данное заболевание действительно вызываетсяопределенным микроорганизмом, необходимовыполнить так называемыепостулаты Коха: 1) показать, что данный микроорганизм регулярно обнаруживается в больном организме; 2) получить культуру этого микроорганизма на искусственной питательной среде;3) воспроизвести данное заболевание заражениемэкспериментального животного выделенной культурой и, наконец, ;4) повторно выделить данный микроорганизм, но теперь уже из организма искусственно зараженного хозяина. Те же постулаты mutatis mutandis справедливы и для диагностики вирусных заболеваний. В этом случае, согласно Риверсу, постулаты формируются следующим образом: 1) выделение вируса из организма больного, 2) культивирование вируса в организме или в клетках экспериментального животного, 3)доказательство фильтруемостиинфекционного агента (чтобы исключить патогенные агенты большего размера, например бактерии), 4) воспроизведение подобного заболевания у другого представителя данного или родственного вида и, наконец, 5) повторное выделение того же вируса.
Культивирование и идентификация вирусов - основные вирусологические методы, используемые в практической вирусологии при диагностике вирусных заболеваний. Материал, в которомподозревается наличие вируса, например лизат бактерий, кусочек ткани или биологическая жидкость, при необходимости измельчают или гомогенезируют с тем, чтобы приконтролируемых условиях перевести его в суспензированное состояние.
Большие фрагменты клеток, атакже возможные загрязняющие материал микроорганизмы удаляют при помощи центрифугирования и фильтрования. Такую очищенную суспензию вводятподходящему хозяину, либо добавляют к суспензии клеток, либонаносят на монослой соответствующих клеток. В результате в слое чувствительных клеток, таких, какбактерии, растущие в чашке с агаром, или клетки животных, растущие на поверхности стекла, могут появиться локальные поражения,так называемые бляшки, которые характерны для данного вируса.. Бляшки образуются в результате заражения расположенных в данной области клеток, размножения в них вируса и их полного или частичного лизиса. Если размножение вируса не ведет к образованию визуально выявляемых дискретных бляшек, вирус может быть обнаружен и охарактеризован по изменениям, вызываемым им вкультуре клеток, или поповреждению слоя клеток либо при помощи других тестов.
Если исследуемый материал не наносят на слой культивируемых клеток, а вводят в организм хозяина, то цель эксперимента - выявление общих реакцийорганизма, свидетельствующих о развитии инфекции: появление симптомов заболевания, гибель животного иликакие-либо иные специфические реакции, напримеробразование антител.
Наконец, если ни заражение культуры клеток, ни введениематериала в организм хозяина не ведут кпоявлению каких-либосимптомов вирусной инфекции, вирусологи прибегают к так называемым «слепым пассажам», т.е. кповторным переносам исследуемого материала, что часто приводит кповышению вирулентностивируса или к увеличению его титра.
Общий химический состав вирусов
Непременным компонентомвирусной частицы являетсякакая-либо одна из двух нуклеиновых кислот, белок и зольные элементы. Эти три компонента являются общими для всех без исключения вирусов, тогда как остальные двалипоиды и углеводы - входят в состав далеко не всех вирусов.
Вирусы, состоящие только из белка нуклеиновой кислоты и зольных элементов, чаще всего принадлежат к группе простых, так называемых минимальных, вирусов,лишенных дифференциации, собственных ферментов или каких-либоспециализированных структур. К такого рода вирусам принадлежат вирусы растений, некоторые вирусыживотных и насекомых. В то же время практически все бактериофаги, которые по химическому составу, безусловно принадлежат к группе минимальных вирусов, на самом деле являются очень сложными и высокодифференцированными структурами. Вирусы, в состав которых наряду с белком и нуклеиновой кислотой входят также липоиды и углеводы, как правило, принадлежат к группе сложно устроенных вирусов. Большая часть вирусов этой группыпаразитирует на животных.
Белки вирусов
Аминокислотный состав вирусных белков
Белок всех исследованных до настоящего времени вирусовпостроен из обычных аминокислот, принадлежащих к естественному L-ряду.D-аминокислот в составе вирусных частиц не найдено. Соотношение аминокислот ввирусных белках достаточно близко ктаковому в белках животных, бактерий и растений.
Вирусные белки не содержат обычно большого количестваосновных аминокислот (аргинина, муцина), т.е. не принадлежат к группе белков типа гистонов и протаминов с ярко выраженными щелочными свойствами. Не учитывая нейтральных аминокислот, можно сказать, что в вирусном белке преобладают кислые дикарбоновые кислоты. Это справедливо как для вирусов с низким содержанием нуклеиновой кислоты, так идля вирусов с высоким содержанием РНК и ДНК.
Вирусная ДНК
Главной структурной особенностью большинства вирусных молекул ДНК, как и ДНК из других источников, является наличие двух спаренных антипараллельных цепей. ДНК-геном вирусов, однако, невелик и поэтому здесь возникают вопросы, касающиесяконцов спирали и общей формы молекулы ДНК, а не монотонной, фактически не имеющей концов «средней» части спирали. Полученные ответы оказались весьма удивительными: молекулывирусных ДНК могут бытьлинейными иликольцевыми, двухцепочечными или одноцепочечными по всей своей длине или же одно цепочечными только на концах. Кроме того, выяснилось, чтобольшинство нуклеотидныхпоследовательностей в вирусномгеноме встречается лишь по одному разу, однако на концах могут находиться повторяющиеся, илиизбыточные участки.
Из всех описанных до сих пор вирусных ДНК наиболее сложно организована ДНК вируса герпеса.Геном здесь, по-видимому, состоит из двух большихсоединенных сегментов, каждый из которых имеетповторяющиеся концевые последовательности. Возможны четыре способа соединения двух таких сегментов конец в конец, и все они как будто бы встречаются в каждом препарате вирионов.
Наибольший из известных вирусов - вирусосповакцины имеет геном размером 15-108 дальтон. ДНК, выделенная из свежего препаратавирионов, по-видимому, имеет поперечные сшивки, так как не разделяется по две цепи. Одна из возможных моделей такой молекулы - гигантская, не подверженнаяденатурации кольцевая структура, образующаяся при замыкании концов линейнойдвойной спирали.
Помимо очень интересных различий в форме молекулы и в структуре концевых участков вирусных ДНК существуют также большиеразличия в величине генома. Среди наименьших «полных» вирусов (т.е. вирусов, способных размножаться в клетке-хозяине) можно назвать фаг ?X174, парвовирусы, паповирусы, вирусы полиомы и SV40.С другой стороны, укрупных бактериофагов и вирусов человека и животных (паприляр, герпеса и осповакцины) геномзначительно больше - от 1 до 1,5.108 дальтон, так что он мог бы кодировать более 100 белков.Действительно, убактериофага Т4 сейчас идентифицировано больше ста генов.
В 1953 г. Уайетт и Коэн сделали неожиданное открытие, весьма существенное для последующих экспериментов: оказалось, что вДНК Т-четных бактериофаговсодержитсяне цитозин, а 5-гидроксиметилцитозин. Это отличие дало возможность изучать фаговые ДНК независимо от ДНК хозяина. Были открытыкодируемые фагом ферменты, которые изменяют метаболизм инфицированной клетки, и она начинает синтезировать компоненты, необходимые вирусу. Еще одно биохимическое отличие ДНК бактериофага состоит в том, что к ее гидроксиметилцитозину присоединены остатки глюкозы: последние, видимо, препятствуют прерыванию фаговой ДНКнекоторыми ферментами хозяина.
В противоположность этому увирусов животных ДНК почти не подвергается модификациям. Например, хотя ДНК клеток-хозяев и содержит многометилированных оснований, у вирусов имеется влучшем случае лишь несколькометильных групп на геном. Большинство вирусных дезоксинуклеотидов не модифицированы, и поэтому нахождение несомненных модификаций представляло бы большой интерес.
Вирусная РНК
Исследования вирусной РНК составили один из самых значительных вкладов вирусологии в молекулярную биологию. Тот факт, что увирусов растенийреплицируемаягенетическая система состоит только из РНК, ясно показал, что и РНК способна сохранятьгенетическую информацию. Была установлена инфекционность РНКвируса табачной мозаики, и выяснилось,что для инфекции необходима вся ее молекула; это означало, что интактность структурывысокомолекулярной РНК существеннодля ееактивности. Неменее важным результатомранних исследований на том жевирусе явилась разработка методом выделения высокомолекулярной РНК иизученияее свойств. Эти методы послужили в дальнейшем основой для изучения различных типов РНК, встречающихся у других вирусов.
Размеры вирионов РНК - вирусов сильноварьируют - от 7.106 дальтон у пикорнавирусов до >2.108 дальтон у ретровирусов; однако размеры РНК и, следовательно, объем содержащейся в ней информации различаются взначительно меньшей степени.
РНК пикорнавирусов - вероятно,наименьшая из известных - содержит около 7500 нуклеотидов, а РНКпарамиксовирусов - едва ли не самая крупная - почти 15000 нуклеотидов. По-видимому, всем независимо реплицирующимся РНК-вирусам нужен какой-то минимуминформации для репликационной системы и капсидного белка, но у них отсутствует очень сложнаядобавочная информация, которой могут обладать крупные ДНК-вирусы.
Вирусные белки
Кроме капсидных белков, образующих «футляр» длянуклеиновой кислоты, у вирусов с оболочками имеются и другие белки.Подобные примеры можно найти среди вирусов животных (в том числе насекомых), растений и бактерий. Кроме белков, входящих в состав нуклеопротеидного «ядра», вирионы могут содержать еще вирус - специфические белки, которыебыли встроены в плазматические мембраны зараженных клеток и покрывают вирусную частицу, когда она выходит из клетки или «отпочковывается» от ее поверхности. Кроме того, унекоторых вирусов с оболочкойсуществует субмембранный матриксный белок между оболочкой инуклеокапсидом. Вторую большую группу вирус-специфических белков составляют некапсидные вирусные белки. Они восновном имеют отношение ксинтезу нуклеиновых кислот вириона.
Аминокислотный состав вирусных белков
Белок всех исследованных до настоящего времени вирусов построен из обычных аминокислот, принадлежащих кестественному L-ряду. Д-аминокислот всоставе вирусных частиц не найдено. Соотношение аминокислот в вирусных белках достаточно близко к таковому в белках животных, бактерий и растений. Вирусные белки не содержат обычно большого количества основныхаминокислот (аргинина, муцина), т.е. не принадлежат к группе белков типа гистонов и протаминов с ярко выраженнымищелочными свойствами. Не учитываянейтральных аминокислот, можно сказать, что в вирусном белке преобладают кислые дикарбоновые кислоты. Этосправедливо как для вирусов с низким содержанием нуклеиновой кислоты, так и для вирусов с высоким содержанием РНК и ДНК.
Химические субъединицы вирусных белков
Резюмируется имеющийся внастоящее время материал о субъединицах вирусного белка, можно сделать вывод, что белковыйкомпонент вирусов, как и все прочие белки, построен из пептидных цепочек. Единственное своеобразие полипептидной цепочки вирусного белка связано с«маскировкой» обеих или какой-либо одной С-или N - концевой аминокислоты, что, видимо, являетсяэволюционным приспособлением, затрудняющим разрушение вирусного белка под влиянием протеазв клетках хозяина. В вирусных частицах пептидные цепочкиопределенным образом взаимодействуют друг с другом, приобретаявторичную и третичную структуру.Именно в такой форме пептидные цепи являются структурными субъединицами вирусного белка, наблюдаемые обычно в электронном микроскопе.
Некоторые общие свойства вирусных белков
Пептидная цепь вирусного белка, за исключением«маскировки» С- или N-концевых групп, не обладает сама по себекакими-либо уникальными свойствами. Она легкогидролизуетсяпротеазамии обнаруживает обычную, характерную для пептидов лабильность по отношению к рядуфизических и химических факторов. В то жевремя белковая оболочка вирусов вцелом характеризуется рядом уникальных особенностей. Прежде всего следует отметить устойчивость цельных частиц к протеолитическим ферментам, легко гидролизующим тканевые белки. В то же времяв некоторых исследованиях сообщается о частичной или полной инактивации как очищенных препаратов вирусов, так и экстрактов, содержащих вирус после инкубации с различного рода протеолитическими ферментами любопытно, что дажеблизкородственные вирусы могут , по-видимому ,различаться почувствительности к протеазам. Так, ни инфекционность, ни гемагглютинирующая активность вирусовгриппа А и С не изменились после инкубации с трипсином, тогда как в аналогичных условияхинфекционность препарата вируса гриппа В снижалась на 87 %, а титр гемагглютининов при этом не изменялся. Оценивая чувствительность того илииного типа вирусов кпротеолитическим ферментам, следует так же иметь в виду, что вирусы обнаруживают дифференциальную чувствительность к различным протеазам. Вирусосповакцины, например, устойчивый ктрипсину и химотрепсину, сравнительно быстро перевариваетсяпапоином, Однако как бы ни был решенвпоследствии вопрос о действиипротеаз на некоторые вирусы, следует все же помнить, что устойчивость к протеазам является широко распространенным свойством белковой оболочкинеповрежденных вирусов. Поэтому при выделении вирусов часто применяютобработку вирусных препаратовпротеометическими ферментами для удаления белковых загрязнений. Такая уникальная устойчивость вирусов к протеазам не связана с индивидуальными особенностями вирусного белка как такового, ибо при частичном поврежденииили легкой денатурации вирусного корпускула, равно как и привыделении вирусного белка в чистом виде, последний легко переваривается протеазами. Поэтомуустойчивость вирусных частиц кдействию протеолитическихферментов нельзя объяснитькакими-либо аномалиями ваминокислотном составе или наличием особого типа связей. Это свойство вирусов обусловлено структурными особенностями корпускула в целом, т.е.третичной и четвертичной структурой белка, и имеет большое биологическое значение, поскольку вирусыразмножаются в клетках, содержащих большое количество протеолитических ферментов. Второй особенностью вирусного белка является , как правило, высокая устойчивость к воздействию ряда физических и химических факторов, хотя каких-либо общих закономерностей вэтом отношенииотметить не удается. Некоторые вирусные виды, выдерживающие необычайно жесткие режимы обработки, способны инактивироваться под влиянием такого невинного фактора, как пониженная или повышенная концентрация солей, лиофилизация и т.п. У четных Т-фагов отделение ДНК от белковыхоболочек («теней») легко достигается быстрым изменениемосмотического давления, так называемым «осмотическим шоком», тогда как нечетные Т-фаги на быстрое уменьшение солевойконцентрации среды не реагируют.
Так же резко различаются вирусы по своей устойчивости всолевых растворах. Одним из наиболее устойчивых в этом отношенииявляется вирус папилломыкроликов, месяцами не теряющий активности в 2 %-ном растворе хлористого натрия и вполунасыщенном растворе сульфата аммония и сохраняющийся в течение десятков лет в50 %-ном раствореглицерина на основании вышеприведенных фактов можнодействительно прийти к выводу, чтоимеются очень стабильные и весьмалабильные виды вирусов, ночаще всего для вирусовхарактернаизбирательная чувствительность к какому-либо определенному видувоздействий наряду с достаточнойстабильностью нуклеопротеидной связи к ряду других факторов внешней среды. Стабильность того или иного вируса копределенным воздействиям нельзя считатьнеизменной, раз и навсегда данной видовой характеристикой. Она, наряду с другими свойствами вирусной частицы, может подвергаться самым радикальным изменениям в результате мутации. При оценке стабильности вирусных частиц необходимо также иметь в виду, что физическая и биологическая инактивация вирусов не всегда совпадает. Чаще всего эти понятия совпадают в случае простых вирусов, у которых отсутствуют специализированные структуры, ответственные за заражение клеток, а физическая и химическая структур