содержание
| |СТР. |
|СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ | |
|ВВЕДЕНИЕ | |
|1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ | |
|1.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ TI-ПЛАЗМИД АГРОБАКТЕРИЙ В ГЕНЕТИчЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ | |
|1.1.1. КРАТКАя ХАРАКТЕРИСТИКА AGROBACTERIUM TUMEFACIENS | |
|1.1.2. CОЗДАНИЕ ВЕКТОРОВ НА ОСНОВЕ TI-ПЛАЗМИД | |
|1.1.3. ПРОЦЕССИНГ ТДНК В БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКЕ | |
|и ее перенос в клетки растений | |
|1.1.4. Разработка система трансформаций растений с | |
|помощью Agrobacterium tumefaciens | |
|1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, | |
|перенесенных в растение | |
|1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных | |
|растениях | |
|1.2. Использование метода генетической | |
|инженерии для трансформации однодольных растений | |
|1.2.1. Краткие характеристики ряски | |
|1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг | |
|тДНК | |
|2. Материалы и методы | |
|2.1. Материалы | |
|2.1.1. Оборудование | |
|2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды | |
|2.1.3. Растения | |
|2.1.4. Среды микробиологические для | |
|культивирования растений | |
|2.1.5. Другие растворы | |
|2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии | |
|2.1.7. Антибиотики | |
|2.2. Методы | |
|2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с | |
|экссудатами тканей растений | |
|2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens | |
|2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну | |
|2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli | |
|3. результаты | |
|4. обсуждение | |
|5. выводы | |
литературы | | |приложение | | |
СПИСОК СОкРАЩЕНИЙ
НУК – нафтиуксусная кислота
БАП – бензиламинопурин
MS –
LB –
тДНК –
Ар – ампицилин
Cs – цефотоксин
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы:
Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений
корончато-галловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-
156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий
опухоль). В процессе идентифицирования растений часть генетического
материала Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая)
перемещается в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, оставаясь
частью наследственного материала. Гены тДНК экспрессируются в
трансформарованных растительных клетках, нарушают их фитогормональный
баланс и определяют синтез специфических ------- соединений.
Таким образом, агробактерии являются природными "генными инженерами",
осуществляющий поразительный по филогенетической дальности перенос
генетической информации. На основе агробактерий сконструированы эффективные
векторные системы для генетической инженерии растений.
Агробактириальная трансформация происходит в результате сложного процесса
взаимодействия между бактериальными и растительными клетками. В этом
процессе одной из решающих стадий является рецепция агробактериями особых
сигнальных молекул, присутствующих в экссудатах поврежденных тканей
растений. Сигнальные молекулы индуцируют экспрессию генов области vir
(агробактериальных Ti-плазмид), контролирующих вырезание тДНК и ее перенос
в клетки растений. Агробактерильная трансформация наблюдается у широкого
круга голосеменных и двудольных растений, однако, она отмечена лишь у
весьма незначительного числа однодольных растений. Одной из причин
ограничений агробактериальной трансформации однодольных считается
присутствие в их клетках сигнальных молекул, индуцирующих процессинг и
перенос тДНК.
Цель работы:
В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия таких
сигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной
работы был анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул,
индуцирующих процессинг тДНК.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии
растений
1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens
За последнее десятилетие в области генетической инженерии растений
достигнуты значительные успехи. Были разработаны разнообразные методы
генетической трансформации и, в настоящее время осуществлена экспрессия
чужеродных генов в растениях многих видов. Наиболее важным для развития
генетической инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевых
образований с помощью Agrobacterium tumefaciens [7].
Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae)
характеризуются присутствием в клетках большой плазмиды, так называемой Ti-
плазмиды, весом более 150 т.п.н. (см. Приложение) [9].
Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных, а
так же у некоторых однодольных растений [2,3]. Для инфицирования in vivo
необходимо повреждение тканей растения [12].
После прикрепления к клеточной стенке растительной клетки агробактерии
переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК) в ядро, где происходит ее
стабильная интеграция в хромосому растения.
Доказано, что функция распознавания клеток и прикрепления к ним, а так же
вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в растительный геном
кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-
области, находящихся на Ti-плазмиде [14].
После переноса в ядро растительной клетки, тДНК может интегрировать в геном
в виде одной или нескольких копий [15]. Встроенная тДНК имеет свойства,
характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах по
гиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). В зависимости от типа Ti-
плазмиды, в тДНК находится от семи до тринадцати генов, ответственных за
опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируют ферменты, участвующие в синтезе
ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время, как ген 4 кодирует
изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5'-
монофосфат [16].
Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к повышению уровня
фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом этого является
повышение митотической активности и образование опухоли. Другие гены тДНК
кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены нопапин
и октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров,
которые служат источником питания для агробактерий [14]. В целом,
образование корончатого галла представляет собой хорошо охарактеризованный
пример генетической инженерии растений в природе.
Мутации в вирулентных генах агробактерий. Наличие Ti-плазмид в клетках
агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности
микроорганизма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны.
На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные
мутации, картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах.
Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как
хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое
связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную
локализацию. В хромосоме расположены некоторые гены, регулирующие
экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеткам
растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное
взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два
связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и
5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов экспрессируются
конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей
получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации
в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не
для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического (-D-
гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки
с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального (-D-гликана в инфекционном
процессе еще точно не установлена. Помимо циклического (-D-гликана в
прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают
участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды.
Организация vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гены агробактерий на Ti- и
Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb,
проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также
гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами
конъюгитивных плазмид. В ----- Ti-плазмидах в области vir локализовано
шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в
единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет
дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas
et al., 1984]. Мутации в генах и --------- vir A, vir G, vir B и vir D
придают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства
хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.
Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной
клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном
растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но
и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных
репликонах). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и
успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической
инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов "вырезания" тДНК
из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее
переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми
границами: несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК
размером 24 ---- , проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti-
и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид.
В этой области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный
разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона,
происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает
сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней.
Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительную клетку
особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярность
переноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии
полностью авирулентными. Замена ее на искусственно синтезированную, так же
как и на левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма.
На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vir D, vir C и
vir E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клетку – мутации
в генах vir B и vir D – оперонов.
1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид
В начале восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести
чужеродные последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью
транспозонного мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980], либо путем сайт-
специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с
Ti-плазмидой дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981].
Однако, эти ранние эксперименты, основанные на двойной рекомбинации,
занимали много времени, были довольно сложны и трансформации проходили с
очень низкой частотой. Необходимо было разработать более эффективные
векторы, чтобы облегчить генетические манипуляции с бактериями и позволить
селекцию и регенерацию трансформатов.
Сейчас используют две принципиально разные системы для введения чужеродных
генов в растения с помощью Ti-плазмид:
---- векторы
бинарные векторы.
В основе создания -------- векторов лежит тот факт, что гены тДНК не ------- для растительных клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между
границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клетки и
нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. В --------
векторых системах тДНК можно заменить, например, на последовательность
pBR322, а чужеродную ДНК, которую предполагается перенести в растения,
нужно проклонировать в этом же векторе.
Затем путем гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть
перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним
из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850
[Zambryski et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за синтез
фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322.
ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для ------- области тДНК pGV3850 с любыми
производыми pBR, несущими клонированный ген.
Гены, кодирующие различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных
растений, были встроены в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Была разработана
система трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322
из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В настоящее
время сконструированы и успешно используются и другие --- ----------
векторы на основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].
Рис. 2.
Схемы -------- (А) и бинарной (Б) векторных систем. vir – область
вирулентности. HOM – области гомологии, в пределах которых может
происходить рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB –
левая и правая границы тДНК. MCS - ----- сайт для клонирования. РТМ –
маркет трансформации для растений. RES – маркер устойчивости к антибиотику
для бактерий. OriT – начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов
при конъюгации. Col E1 – начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало
репликации из плазмиды широкого круга хозяев RK2.
Система бинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir
могут распологаться на разных плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких
системах обычно присутствуют два элемента:
Ti-плазмида-помощник, в которой тДНК польностью делетирована. Эта плазмида
несет в своем составе гены vir, действующие in trans.
Плазмида широкого круга хозяев, имеющая сайты для клонирования и маркерные
гены для селекции растений, ограниченные правой и левой фланкирующими
последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис
Обе описанные выше системы векторов предполагают --------- этапах сборку
нужных конструкций в промежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena,
Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в
готовом виде в рецепиентные штаммы агробактерий.
1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке
и ее перенос в клетки растений
Формы процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciens
с механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами
или в присутствии --------- из клеток бактерий можно выделить различные
молекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные,
двуцепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые, которые могут
претендовать на роль посредника в переносе генетического материала в
растительную клетку [-------, 1980]. Причем кольцевая форма, образующаяся
за счет гомологичной рекомбинации между правой и левой границей тДНК с
образованием одной гибридной границы, встречается в очень малых
количествах. При ее образовании не происходит репликативного синтеза ДНК, в
то время как в случае образования двух других форм, возможно прохождение
репликации тДНК в бактериах в процессе ее транспотра в растения (к
появлению одноцепочечных форм может приводить прерывание, ингибирование
прерывистого синтеза запаздывающей цепи). Репликация призвана обеспечить
сохранение тДНК в исходной Ti-плазмиде, если только не допустить
возможность существования физического вырезания материала тДНК из Ti-
плазмид за счет образования двухцепочечных разрывов в границах.
Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является главным недостатком отошедшей на
второй план подобной "эксцезионной модели". Тем не менее, образование
двуцепочечных разрывов внутри границ и появление детектируемых количеств
линейной двуцепочечной формы тДНК при культивировании бактериальных клеток
в присутствии ---------- исследователи наблюдали уже через 30 минут после
добавления этого индуктора в среду. Так же в условиях индукции vir-генов ---
------ в клетках агробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма
процессированной тДНК [Stachel et al., 1986].
Появление этого интермедиата обнаруживается через восемь часов после
добавления индуктора, и его количество накапливается на протяжении
последующих 40 часов более, чем в два раза, а затем идет на убыль,
показывая, что процесс лимитирован.
Какая из форм транслоцируется через бактериальную мембрану в бактериальную
клетку до сих пор остается не выясненным из-за трудности определения
относительного количества каждой из форм и выявления динамики их
превращения. Возможно, процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени
и идут сопряженно подобно конъюгационному переносу плазмид, происходящему в
месте контакта мембран конъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979]. Тогда
все обнаруживаемые интермедиаты могут быть аберрантными формами прерванного
на каком-то этапе неделимого процесса (или неправильно завершенного). В
случае индуцированной экспрессии vir-генов ------- отсутствует главный
элемент взаимодействия – контакт бактериальной клетки и растительной
клетки, и, поэтому, все обнаруживаемые в этом случае формы могут
претендовать на роль посредника лишь с определенными допущениями.
Достоверно известно, что в растительную клетку попадает только одна цепь
тДНК и конвертируется в двуцепочечную уже в растительной клетке.
Обсуждается, что в случае прохождения в клетке Agrobacterium tumefaciens ---
----- полуконсервативной репликации тДНК вторая цепь может в процессе
переноса гидролизоваться, высвобождая энергию для транспорта переносимой
цепи.
1.1.4. Разработка система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciens
Большинство первоначальных экспериметнов по генетической трансформации
растений было предпринято с помощью заражения пораненных растительных
клеток с помощью агробактерий с немодифицированными Ti-плазмидами. Для
сохранения стерильности часто инфицировали эксплантаты in vitro вместо
целых растений. Бактерии затем удаляли, добавляли в среду цефотоксин или
карбенициллин. Трансформанты отбирали на безгормональной среде.
В дальнейшем по мере создания обезоруженных векторов и новых селективных
маркеров, был разработан более эффективный метод, дающий большое число
трансформантов: кокультивирование агробактерий с растительными
протопластами либо с эксплантантами листьев. Было показано, что
кокультивирование протопластов с агробактериями, либо с бактериальными -----
---, приводит к образованию опухоли [Marton et al., 1979, Wullems et al.,
1981]. Затем подобный подход был успешно применен для трансформации
растительных клеток агробактериями, несущими в составе тДНК химерные
селективные маркеры [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].
Этот метод был в дальнейшем улучшен использованием так называемых фидерных
культур [Fraley et al., 1983]. Однако, все перечисленные методы пригодны
только для трансформации растений, которые можно легко регенерировать из
протопластов (например, табак и петуния). Эту проблему мрожно легко
преодолеть кокультивируя агробактерии с листовыми дисками вместо
протопластов [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986].
Стерильные листовые диски --------- с агробактериями, несущими в составе
обезоруженного вектора какой-либо селективный маркер устойчивости к
антибиотику. Затем кусочки листьев культивируют два дня на фидерных чашках
со средой для образования побегов. После этого их переносят на среду с
цефотоксином для уничтожения бактерий и с каким-либо антибиотиком
(например, с ---------) для отбора трансформантов. Регенерировавшие побеги
дают корни, после чего растения переносят в почву для проведения дальнейших
экспериментов.
Поскольку метод трансформации листовых дисков представляет собой идеальное
сочетание высокой частоты трансформации с легкой и быстрой ------- и
регенерацией трансформантов, этот подход стали использовать во многих
лабораториях мира. Кроме того были предложены некоторые модификации метода.
Для повышения частоты трансформации листовых дисков Arabiodopsis было
предложено обрабатывать агробактерии --------- [Sheikholeskam a. Week S,
1987], который является индуктором генов vir [Stachel et al., 1985]. Однако
метод трансформации листовых дисков применим для трансформации только тех
видов растений, которые могут регенерировать побеги из недифференцированных
клеток в месте поранения.
Наряду с методом трансформации листовых дисков широко используются
конъюгированные агробактерии со стеблевыми сегментами [An et al., 1986],
клетками суспензированной культуры [Scott a. Draper, 1987], микрокаллусами
[Pollock et al, 1985] и прорастающими семенами [Feldmam a. Markis, 1987].
Метод трансформации семян агробактериями был впервые применен для
арабидопсиса и заслуживает особого внимания, так как не требует работы с
культурой ткани.
1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение
Чужеродные ДНК, перенесенные в растительные клетки с помощью различных
методов, обычно встраиваются в ядерный геном и наследуются в соответствии с
законами Менделя [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Области
ингерации, по видимому, распределены случайным образом по геному.
Встраивание генов по определенным сайтам было ранее описано в системах
животных клеток [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] и недавно подобный
подход был успешно применен для трансформации растений [Paszkowski et al.,
1988].
В большинстве случаев последовательности чужеродной ДНК встраиваются в один
локус либо в одной копии, либо в виде кластера тандемных вставок, что было
показано с помощью гибридизации in situ [Mouras et al., 1986]. Однако,
часто наблюдаются множественные вставки в два или более участков на разных
хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a.
Marus, 1987]. В связи с этим во многих случах была получена
контрансформация физически несцепленных генов, сегрегация некоторых
проходила в поколении F1 [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986].
Чужеродыне гены обычно передаются потомству с высокой степенью стабильности
при мейозе [Muller et al., 1987]. Однако, иногда наблюдали случайную потерю
трансформированного фенотипа после мейоза [Potrykus et al., 1989].
Возмножно, это происходило из-за активации чужеродного гена (например, при
метилировании ДНК). Интеграция чужеродной ДНК во внеядерные геномы,
например, в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], так же происходит по
неменделевскому типу наследования – по материнской линии.
Используя метод гибридизации по Саузерну [Southern, 1975] для анализа
трансформантов и их потомства, многие исследователи показали, что часто
наблюдается встраивание укороченных, тандемных или перестроенных копий
чужеродных генов, особенно после прямого переноса ДНК в протопласты [Krens
et al., 1985]. Появление тандемов, часто от 5 до 20 копий, можно объяснить
рядом рекомбинаций перед интеграцией в геном [Szernilofsky et al., 1986;
Wirtz et al., 1987]. Образование инвертированных повторов является основным
типом перестроек чужеродной ДНК при применении векторов, содержащих тДНК ---
-- Ti-плазмиды [Jorgensen et al., 1987].
Итак, при проведении опытов по трансформации растений, необходимо принимать
во внимание тот факт, что чужеродная ДНК может подвергаться различным
модификациям перед встраиванием в геном хозяина. Однако, и после интеграции
могут происходить различные ее перестройки, обычно во время мейоза
[Czernilofsky et al., 1986]. В таких случаях только перекрестное опыление
тщательно отобранных трансформантов с наиболее желаемым генотипом и
фенотипом дает потомство с предсказуемыми призанаками.
1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях
Для качественного и количественного анализа экспрессии чужеродных генов в
растениях используют множество методов, включая Нозери-анализ РНК [Nagy et
al., 1988] и Вестери-анализ продуктов трансдукции [Burnette, 1981]. Кроме
того, изучают фенотипические признаки такие как, устойчивость к
антибиотикам и гербицидам. Для анализа экспрессии таких репортерных генов,
как cat, npt II, гены октопин- и -------- разработаны чувствительные методы
[Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].
Такого рода анализ может иметь большое значение, поскольку можно
комбинировать кодирующие последовательности репортерных генов с подходящими
регуляторными последовательностями растительных генов, либо создавать
двойные гены, экспрессирующиеся с одного и того же промотора. Активность
гена и промотора можно таким образом определить либо с помощью
ферментативного анализа, либо гибридизацией растительной РНК с зондами,
комплементарными репортерному гену.
Перечисленные выше разнообразные методики можно успешно применять для
анализа экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях, в частности,
генов устойчивости к гербицидам, насекомым, облучению, антибиотикам и др.
1.2. Использование метода генетической
инженерии для трансформации однодольных растений
1.2.1. Краткие характеристики ряски
Семейство рясковые, Lemnaceae включает 6 родов и 30 видов, встречающихся на
всех континентах. Наиболее широко они распространены в Северной и Южной
Америке, Африке, Австралии. Представители семейства рясковые являются
самыми маленькими в мире цветковыми растениями, венчики которых редко
превышают 1 см. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней
степени редукции всех своих органов, поэтому и по простоте строения
занимают первое место среди цветковых.
Рясковые – водные, свободноплавающие, большей частью многолетние
травянистые растения. По своей природе рясковые являются неотеническими
формами произошедшими от предков современного водоплавающего рода Пистия из
семейства Ароидных. Рясковые служат кормом для диких и домашних уток, а так
же других водоплавающих и болотных птиц, для рыб, особенно карпа, и
ондатры. В сельском хозяйстве их используют в свежем и сушеном виде как
ценный белковый корм для свиней и домашней птицы. Применяются рясковые и
для очистки воды, так как извлекают из нее и запасают в своих листьях азот,
фосфор, калий, а так же поглощиют углекислый газ и обогащают воду
кислородом. Употребляются и человеком.
За последние 50 лет рясковые рассматриваются, как чрезвычайно ценный
экспериментальный объект для морфогенетических, физиологических и
биохимических исследований благодаря неприхотливости к среде, малым
размерам, быстрому росту, что позволяет использовать всего один
генетический клон на протяжении всего эксперимента.
1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК
Экспрессию генов vir-области индуцируют специфические сигнальные молекулы
посредством позитивной регуляции системы в состав которой входят гены virA
и virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].
Активаторами транскрипции vir-генов являются низкомолекулярные
моноциклические фенольные соединения, синтезируемые в механически
поврежденных тканях растений [Stuchel, 1985]. Примерами таких соединений
являются ----------- и довольно широкий круг производных -------
биосинтетического пути метаболитов защитной природы или предшественников
лигнина.
Сигнальные молекулы были впервые обнаружены в экссудатах корней и листьев
двудольного растения Nicotiano tabacum, они были идентифицированы как -----
и -------. Эти соединения синтезировали метаболически активные поврежденные
ткани растений. В настоящее время установлена сигнальная индуцирующая
активность у большой группы ------- соединений растительной природы.
Механическое повреждение тканей растений приводит к усилению синтеза таких
сигнальных соединений. Известно, что ------------ и коричная кислоты,
проявляющие сигнальную активность, обладают так же антимикробными
свойствами и являются промежуточными метаболитами на пути синтеза -------.
---------- распознаются специфическими рецепторами агробактерий,
являющимися трансмембранными хеморецептргыми белками с различной ------- к
таким молекулам [Leroux, 1987]. Для оптимальной индукции экспрессии генов
vir требуется присутствие в эксцудатах растений различных углеводов:
глюкозы, глюкуроновой кислоты, галактозы, галактуроновой кислоты,
арабинозы, маннозы, фукозы, целлобиозы и ксилозы, представляющих компоненты
клеточной стенки растений. Такие углеводы связываются с периплазматическим
доменом рецептора в виде предварительно обработанного комплекса с белком-
продуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, причем конечный результат
индукции процессинга тДНК зависит от синергической активности сигнальных
соединений и сахаров эксцудатов растений.
Структурная формула:
Позитивная регуляторная система vir A – vir G, контролирующая экспрессию
генов vir -----, работает следующим образом. Экспрессируемый конститутивно
ген vir A выполняет функцию рецепции сигнальных молекул растений и
трансмиссии этого сигнала в бактериальную клетку. Этот мембранный
хеморецептор после принятия внешнего сигнала активирует продукт гена vir G,
который в свою очередь выступает в качетве позитивного регулятора
собственной транскрипции и транскрипции остальных генов vir -----.
Механизмы активации следующие.
Белок vir A, дважды пронизывающий мембрану бактерии, при появлении
сигнальных молекул автофосфорилируется --------- на своем С-конце, переходя
в активную форму. (В отсутствии индукции С-терминальный домен белки vir A
взаимодействуют с W-терминальным доменом, ингибируя киназную активность).
Активированный белок vir A в свою очередь --------- внутренний клеточный
белок – трансдуктор сигнала vir a по остатку аспарагина – 52 [Jin et al.,
1990]. Фосфорилированный белок vir G связывается с промоторами остальных
генов регулона и со своим собственным, выступая в качестве
транскрипционного активатора. Индукция vir генов обратимая, и каскад
реакций может быть прерван, что очень важно для патогена: в случае, если
хозяин больной и нежизнеспособный организм, перенос тДНК в его клетки не
осуществляется [Hess et al., 1991].
Кроме позитивной регуляторной системы vir A – vir G, локализованной на Ti-
плазмиде, в регуляции экспрессии vir-генов принимают участие также
хромосомные гены. Об этом свидетельствует обнаружение спонтанного
хромосомного мутанта ros, у которого гены vir C и vir D – оперонов
экспрессируются в отсутствие сигнальных молекул растений.
3. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Оборудование
Копалка, термомиксер 5436, центрифуга "Эппиндорф", прибор для горизонтального электрофореза, источник питания 2197, термостат ТС–80 Мг.
2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды
Штамм: |Escherichia coli
HB 101
Agrobacterium tumefaciens
C58C1 | |Плазмиды: |рGV3850 | |тДНК: |рBR322 маркер Ар, Тс | |
2.1.3. Растения
В качестве объектов исследования использовали двух–, трехмесячное
однодольное растение ряски крошечной (Lemna perpusilla).
Растения выращивали в теплице в вегетационных сосудах при температуре
18–250 С и 12 часовом световом периоде. Относительную влажность воздуха в
теплице поддерживали в пределах 65–70%. Для анализа брали стерильные ткани
листьев. Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5–10 минут, а
затем материал 3 раза промывали стерильной водой и использовали в
экспериментах по индукции vir–генов Ti–плазмид. Для сравнения были взяты
двудольные растения табака красного и льна долгунца.
2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений
В работе использовали среды:
Для микроорганизмов – LB (Лурия–Бертани)
NaCl
Дрожжевой экстракт
Бантотриптон |10 мг/л
5 г/л
5 г/л | |рН 7,5
Температура 240 С
Длина светового дня 16 часов
На чашку Петри:
LB
штамм |10 мл
1 мл | |Для культивирования растений – среда MS (Мурасиге–Скуча) приведена
в таблице.
2.1.5. Другие растворы
Фосфатный буфер
ТЕ буфер (10 мМТрис–HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА)
Саркозилат Na
Проназы – 1,5 мг/мл
Фенол
Хлороформ
Агарозные гели
Фитогормоны:
БАП (6–бензиламинопурин) растворяли в растворе 0,1 – NaOH
HУК (2–нафтилуксусная кислота) растворяли в этаноле и разводили водой до 10
мг/мл. Стерилизовали фильтрованием через фильтры В 485.
Ацетосирингон растворяли в 70% спирте (этаноле) в концентрации 10 мг/мл.
Добавляли в среду MS до конечной концентрации 100 мМ.
2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии
Гидролиз ДНК проводили рестрикционными эндонуклеазами:
Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.
2.1.7. Антибиотики
Ампицилин 50, Н2О 50. Для селекции бактерий с определенными плазмидами.
Методы
2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений
Ночную культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), выращенную на ротационном
шейкере (20 циклов/мин) при 290 С в жидкой среде LB, собирали
центрифугированием и суспензировали в среде МС – 0,1 М фосфатном буфере (рН
5,5) до кислотности А600 – 0,05.
После 5 часов роста в бактериальную культуру добавляли мелконарезанные
стерильные ткани растений (листья, стебли) в количестве 2 г на 10 мл среды
и продолжали инкубацию в течение 48 часов.
В качетве положительного контроля использовали агробактериальную культуру с
добавлением в качестве индуктора 100 мкМ ацетосирингона. В качестве
отрицательного контроля использовали агробактериальные клетки, выращенные
на среде без ацетосирингона и эксцудатов растений.
Эффективность индукции процессинга тДНК церез 48 часов инкубации
агробактерий с тканями растений. Титр жизнеспособных бактерий после
инкубации с эксцудатами растений проверяли путем их высева в различных
разведениях на чашки Петри с агаризованной средой LB. Каждый вариант опытов
проводили в трех повторностях.
2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens
ДНК выделяли по модифицированному методу Draper с соавт.Через 48 часов
совместного культивирования агробактерий с тканями растений из пробирок
удаляли растительную ткань, бактерии собирали, центруфугировали при 9000 g.
Осадок, полученый из 10 мл инкубационной среды лизировали в течение 45 мин
при 370 С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА),
содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг/мл проназы. Лизат дважды
экстрагировали фенолом и дважды хлороформом. ДНК осаждали спиртом и
растворяли в ТЕ–буфере.
2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну
В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутствия
в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерий в количестве 5 мкг наносили в
лунки 0,8% агарозного геля и проводили электрофорез при 25–100 В в течение
2 часов в буфере, содержащем: 40 мМ трис–ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА и 5
мкг/мл бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярного веса
использовали ДНК фага (, гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind
III. Блод–гибридизацию проводили на ––––– фильтрах. В качестве зонда
использвали ДНК плазмиды pBR322, меченную 32 –– с помощью ДНК–полимеразной
системы.
2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli
Штаммы E. сoli HB101 выращивали в жидкой среде LB при 370 С до концентрации
5*107 клеток/мл (А600 = 0,45). Для количественного изучения процессинга
тДНК использовали комплементарные клетки бесплазмидного штамма E. сoli
HB101, которые трансформировали тотальной ДНК агробактерий, которая была
выделена (М-2), претерпевших различную переработку. Трансформанты каждого
варианта высевали на три чашки Петри с агаризированной средой LB,
содержащей ампицилин (50 мкг/мл). Количество колоний подсчитывали. В
контрольных экспериментах клетки трансформировали плазмидой pBR322, и
другой контроль не был подвергнут трансформации и колоний обнаружено не
было.
3. результаты
Для обнаружения процессинга агробактериальной тДНК, индуцированного
экссудатами анализированных растений, в работе применяли метод "спасения
плазмиды", предложенный Koukolikova-Nikola с соавт. Этот метод основан на
использовании модифицированной Ti-плазмиды pGV385 [11], содержащей между
правой и левой границами значительно делетированной исходной тДНК
бактериальной плазмиды вектор pBR322. Таким образом, индуцирование
процессинга тДНК в модифицированной Ti-плазмиде pGV3850 можно прослеживать
по вырезанию из нее низкомолекулярного фрагмента ДНК, в состав которого
входит плазмида pBR322. Этот процесс можно тестировать различными методами.
Один из них – это трансформация клеток E. сoli тотальной агробактериальной
ДНК и отбор трансформантов по селективным маркерным признакам плазмиды
pBR322 – устойчивой к антибиотикам. Другим методом может быть блод-
гибридизация – анализ тДНК с помощью плазмиды pBR322 в качестве
гибридизационного зонда. Оба этих метода были использованы в настоящей
работе. Сравнили эффективность индукции процессинга экссудатами различных
растений проведено по отношению к активности 100 мкМ ацетосирингона.
Известно, что это токсифенольное соединение, выделяемое некоторыми
двудольными растениями, принадлежит к сигнальным молекулам, индуцирующим
вырезание и перенос агробактериальной тДНК.
Результаты трансформации клеток E. сoli НВ101 тДНК подвергнутых воздействию
экссудатов листьев различных растений представлены в таблице.
Таблица 3.1.
Факторы индукции |Количество трансформированных E. Coli | |L. perpusilla
(ряска)
L. perpusilla (ряска)
Ацетосирингон (контроль)
Лен долгунец
Nicotiana tabacum (табак)
Без ацетосирингона и трансформации |25 колоний
30 колоний
35 колоний
40 колоний
30 колоний
– | |
Экссудаты листьев ряски индуцировали вырезание тДНК, что является
доказательством присутствия в их составе сигнальных соединений,
специфических для индукции транскрипции генов vir агробактериальной Ti-
плазмиды.
Прямой блод-гибридизационный анализ тДНК агробактерий св