Введение.
Одним из ключевых вопросов генетики человека является вопрос о строении и функционировании материальных основ наследственности. Сведения по каждому из трех уровней организации наследственных структур (генному, хромосомному, геномному) накапливаются в последние годы с удивительной быстротой, и можно надеяться, что недалеко то время, когда будет составлена довольно цельная картина наследственности человека. Уже и сейчас по этому вопросу человека можно отнести к числу наилучшим образом изученных объектов наряду с дрозофилой, мышью, кукурузой.1
Для правильного понимания значения наследственности в патологии человека необходимо иметь подробные сведения по трем частично взаимосвязанным разделам:
1) по морфологическому и химическому строению хромосом и кариотипа в целом; 2) по дискретным признакам человека, контролируемым единичными генами («инвентаризация» единиц наследственной изменчивости); 3) по «архитектонике» генов в хромосомах (сцепление генов и карты хромосом). По каждому из этих разделов накоплено много данных, их интенсивная разработка продолжается как в теоретическом, так и прикладном (клиническом) аспектах.
Принципы и основные разделы общей цитогенетики сформировались в течение 20-х и 30-х годов в основном благодаря исследованиям, проведенным на дрозофиле и некоторых растениях. Цитогепетика человека и млекопитающих, занимающая ведущее место в современой цитогенетике, развилась позже, главным образом в связи с методическими трудностями.
Историю развития цитогенетики человека можно разделить на три периода. Первый охватывает период с прошлого века до середины 50-х годов и имеет сейчас сугубо исторический интерес. Это были поиски методических подходов к получению препаратов хромосом человека замечательными своей настойчивостью и трудолюбием цитологами того времени (А. Г. Андрес, 1934). Хотя нашими цитогенетиками А. Г. Андресом и М. С. Навашиным были правильно описаны первые 10 пар крупных хромосом, однако не было достоверно установлено даже общее число хромосом в клетках человека. Неизвестной оставалась также их морфология.
Второй период, начало которому было положено работой Tjio и Levan в 1956 г., характеризовался возникновением и бурным развитием современной цитогенетики человека. Довольно быстро были разработаны все основные методические приемы хромосомного анализа, получены фундаментальные сведения о кариотипе человека, об основных особенностях строения и функционирования его нормальных хромосом. Именно в этот период зародилась медицинская цитогенетика, которая открыла новую область патологии человека, обусловленную изменением числа или структуры хромосом.
Третий период развития цитогенетики человека начался в 70-х годах. Его по праву можно считать началом современного этапа в развитии науки о цитологических основах наследственности человека. Ряд методических нововведений обеспечили переход цитогенетики на качественно иной уровень. Реализовалась возможность изучения индивидуальности хромосом человека и даже их участков. Это сразу подняло на новый уровень медицинскую цитогенетику. Стало возможным исследовать комплексно морфологию, функцию, химические особенности строения и надмолеку-лярную организацию хромосом человека. Развитие в эти же годы методов генетического картирования хромосом человека обеспечило решение самой сложной задачи — создание генетических карт хромосом.
Таким образом, современная цитогенетика человека представляет собой богатую фактическим материалом, разветвленную самостоятельную область генетики человека. В настоящее время задача идентификации всех элементов человеческого кариотипа при анализе на стадии митоза решена на основе применения дифференциальных окрасок хромосом.
Хромосомы как индивидуальные структуры становятся доступными для исследования после значительного укорочения и утолщения, которые они испытывают в период подготовки клетки к делению. Для соматических клеток таким делением является митоз, для генеративных — сначала митоз, а затем мейоз.
Глава 1. Митотические хромосомы.
Основные сведения о хромосомном наборе человека в целом и об индивидуальных хромосомах получены в результате изучения хромосом в метафазе митоза. На этой стадии митоза отчетливо видно, что диплоидный набор хромосом человека состоит из 46 элементов: 22 пар аутосом и одной пары половых хромосом (XX у женщин и XY у мужчин). На стандартно окрашенных препаратах форма метафазных хромосом определяется местоположением первичной перетяжки, которая формируется благодаря деконденсации функционирующего в метафазе центромерного района. В отдельных хромосомах могут существовать дополнительные перетяжки, называемые вторичными. В случае локализации такой перетяжки на конце хромосомы отделяемый ею дистальный участок хромосомы называется спутником.
По форме и общим размерам все аутосомы человека легко подразделяются на 7 групп, обозначаемых латинскими буквами от А до G (рис. 8). Помимо этого, все аутосомы в порядке уменьшения общей длины нумеруются (от 1 до 22).
Длина одной и той же хромосомы в митозе значительно варьирует, поскольку и в стадии метафазы продолжается процесс естественной конденсации хромосомы, который значительно усиливается колхицином. Поэтому для идентификации служит показатель относительной, а не абсолютной длины хромосомы. Однако его надежность ограничивается тем, что хромосомы обладают разной длиной, а в данной хромосоме плечи разных размеров сокращаются неодинаково: укорочение более длинных происходит быстрее по сравнению с короткими. Это не отражается на указанной выше групповой характеристике, но препятствует идентификации близких по размеру и форме хромосом внутри групп. Затруднения в индивидуальной идентификации хромосом усиливаются также тем, что дифференциальная конденсация может иметь место и между гомологичными хромосомами, обусловливая гетероморфизм гомологов. В настоящее время потребность в использовании метода морфометрии и определяемых с ее помощью линейных параметров хромосомы фактически отпала в связи с введением в практику хромосомного анализа дифференциальных окрасок хромосом.2
Анализ спонтанных вторичных перетяжек, включая спутничные, заметно не облегчает распознавание отдельных хромосом. С их помощью наиболее регулярно можно выделить аутосому 9, часто обладающую значительной перетяжкой в околоцентромерном районе длинного плеча. Спутничной перетяжкой обладают все десять акроцентрических хромосом человека, a D- или G-хромосомы по этому признаку в пределах групп не различаются.
Морфологическая однородность хромосомы по длине, как она вырисовывается при микроскопическом изучении метафазных хромосом на рутинно приготовленных и окрашенных препаратах, на самом деле оказывается обманчивой. Методический прогресс в цитогенетике человека и высших эукариотов в целом, который имел место на протяжении последних 15—20 лет, привел к открытию глубокой линейной дифференцированности хромосомы в отношении и структуры, и функции. Эта дифференцированность, индивидуальная для каждой хромосомы, сравнительно легко выявляется в метафазе митоза. Благодаря этому в современной цитогенетике человека можно идентифицировать все хромосомы не по отдельным и случайным признакам, а по существенным сторонам их структурно-функциональной организации. В практике цитогенетического анализа с этой целью.исследуют дифференциальную конденсацию хромосом, хронологию репликации ДНК в хромосомах или дифференциальную окрашиваемость хромосом (А. Ф. Захаров, 1977).
Дифференциальность конденсации участков хромосомы — одна из существенных ее характеристик, наиболее полно выраженная в интерфазном ядре. В естественных условиях течения митоза хромосомные участки, резко различающиеся по степени конденсации в период интерфазы, в метафазе выглядят практически одинаково. Лишь при специальных способах световой или электронной микроскопии удается обнаружить неоднородную линейную структуру внешне гомогенной метафазной
хромосомы (Bahr, Larsen, 1974). Выравнивание циклов конденсации в разных участках хромосом можно затормозить искусственно. С этой целью особенно успешно применяется 5-бромдезоксиуридин (А. Ф. Захаров, 1973, 1977;
Dutrillaux, Lejeune, 1975). В присутствии этого вещества хромосомы вступают в метафазу неравномерно уплотненными по своей длине. В результате тщательного изучения их морфологии показано, что каждая хромосома человека имеет строго постоянное и специфическое чередование нормально и слабо конденсированных участков и по этому признаку может быть идентифицирована.
Внутрихромосомная асинхронность репликации ДНК является второй важнейшей чертой линейной неоднородности хромосомы, которая может быть выявлена в метафазе митоза. В течение полутора десятков лет эта черта хромосомной организации была доступна изучению методом радиоавтографии хромосом (под ред. А. А. Прокофьевой-Бельговской, 1969; А. Ф. Захаров, 1977; Giannelli, 1970, 1974). На основе этого метода были вскрыты принципиальные закономерности репродукции хромосом человека, среди которых асинхронность репродукции разных участков хромосомы, постоянство и специфичность порядка репродукции для данной хромосомы являются важнейшими. Однако идентификацию индивидуальных хромосом радиоавтография продвинула меньше, чем этого ожидали. На радиоавтографах дополнительно удается различить аутосомы 4 и 5, 13, 14 и 15, 17 и 18. В женских клетках одна из двух Х-хромосом отличается поздним началом и поздним окончанием синтеза ДНК. Несмотря на ограниченность данных, получаемых методом радиоавтографии, этот прием оказался исключительно полезным в улучшении идентификации аномалий указанных хромосом и помог в выделении нескольких новых самостоятельных синдромов в хромосомной патологии.
Существенный прогресс в изучении последовательности синтеза ДНК по длине каждой хромосомы человека в норме, ее взаимосвязи с другими характеристиками хромосомной организации, ее состояния в случаях численных или структурных изменений в хромосомном наборе происходит в настоящее время благодаря использованию в качестве предшественника синтеза ДНК аналога тимидина — 5-бромдезоксиуридина. Ослабленная способность к окрашиванию участков хромосомы, включивших этот предшественник, вооружила цитогенетиков точным методом изучения хронологии хромосомной репродукции, возможности которого лимитируются лишь разрешающей способностью световой микроскопии. Репликационная структура всех хромосом человека выявляется с предельной ясностью, и она может быть описана в четких морфологических терминах.
Каждая хромосома состоит из участков, реплицирующихся в разное время. Имеется четкое чередование районов с ранней и поздней репликацией. В метафазной хромосоме
такие участки хорошо различимы с помощью светового микроскопа. Специфичность репликационной структуры каждой хромосомы складывается из индивидуальности размеров, числа и взаимного расположения различающихся хромосомных районов (рис. 9).
В отличие от изложенных выше двух феноменов неравномерного окрашивания хромосом по длине, вызванного включением в ДНК 5-бромдезоксиуридина, под дифференциальной окрашиваемостью хромосом подразумевается способность к избирательному окрашиванию по длине хромосомы, не модифицированной прижизненно какими-либо воздействиями. Дифференциальное окрашивание хромосом в этом случае обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированную хромосому.
Важно отметить, что при всем разнообразии подобных обработок хромосомных препаратов после фиксации и применяемых флуорохромных или нефлуоресцирующих красителей выявляемая линейная неоднородность хромосомы всегда одна и та же. Ее рисунок меняется только в зависимости от степени уплотненности хромосомы: в более длинных, слабее сокращенных хромосомах становится заметной дальнейшая неоднородность тех сегментов, которые выглядели гомогенно окрашенными в сильно конденсированных хромосомах. Дифференциальное окрашивание может наблюдаться либо по всей длине хромосомы (Q-, G- и R-сегменты), либо в ее центромерном районе (С-сегменты).
Наиболее ясное представление о рисунке дифференциального окрашивания хромосом по всей длине можно получить при окраске препаратов по G-методике, используя краситель Гимзы (рис. 10). На таких препаратах хромосомы выглядят поперечно исчерченными, по-разному окрашенными сегментами («banding»). Рисунок каждой пары хромосом является специфичным для нее. Размеры сегментов неодинаковые. В мелких хромосомах групп F и G рисунок образуется единичными сегментами, в крупных хромосомах их много. Общее количество окрашенных и неокрашенных сегментов в нормальном хромосомном наборе средней степени конденсации, в соответствии с Парижской номенклатурой, равно 322. В прометафазных хромосомах их число увеличивается до 1000 и более.
На Парижской конференции по номенклатуре в цитогенетике человека была разработана и в настоящее время вошла в практику цитогенетического анализа система обозначения сегментов нормальных хромосом и хромосом, подвергшихся тем или иным структурным перестройкам (Paris Conference, 1971). На рис. 11 приведен пример этой системы для аутосомы 1.
Независимо от того, как решается вопрос о природе дифференциальной окрашиваемости хромосом, основанные на этом феномене цитологические карты имеют исключительное значение для развития цитогенетики человека. С их помощью удается отнести генетические маркеры не просто к тому или иному хромосомному плечу, а к определенному району хромосомы. В медицинской цитогенетике стало реальным выявление происхождения аномальных хромосом вплоть до точного описания районов.
Второй вид дифференциального окрашивания хромосом вскрывает специфичность околоцентромерных районов в хромосомах человека. В разных хромосомах размеры С-сегментов разные, они особенно велики в аутосомах 1, 9 и 16. Однако идентифицировать по этой окраске сходные по величине и форме хромосомы не удается. В Y-хромосоме С-хроматин локализуется в дистальной части длинного плеча. В одной и той же хромосоме у разных индивидов его содержание может различаться.
Глава 2. Мейотические хромосомы.
Мейоз объединяет серию различных процессов, в ходе которых первичные зародышевые клетки дифференцируются в зрелые половые клетки. В начале этой серии сперматогонии (оогонии) превращаются в первичные сперматоциты (ооциты). Центральным событием является первое мейотическое деление сперматоцита (ооцита), в ходе которого хромосомы испытывают особенно сложные специфические преобразования в период профазы. Первая мейотическая профаза разделяется, как известно, на пять стадий: лептотену, зиготену, пахитену, диплотену и диакинез. В отличие от митоза, профаза которого в цитогенетическом анализе практически не используется, профазные хромосомы первого мейотического деления представляют очень большой интерес для цитоге-нетики человека. Метафазные хромосомы первого мейотического деления, являющиеся бивалентами гомологичных хромосом, представляют собой менее дифференцированные структуры по сравнению с метафазными митотическими хромосомами. Хромосомы второго мейотического деления почти не используются в цитогенетике человека.
Протекание мейоза в мужском и женском организме значительно различается в нескольких отношениях: период онтогенеза, продолжительность отдельных фаз, морфология митотических преобразований.
У мужчин мейотические деления начинаются в период полового созревания и протекают непрерывно на протяжении всего последующего половозрелого состояния. Этот процесс в отличие от женского мейоза не носит циклического характера. В семенниках одновременно созревает большое количество гамет, поэтому гонады половозрелого мужчины могут служить источником мейотически делящихся клеток в любой момент. На хромосомных препаратах одновременно удается видеть различные мейотические фигуры, от сперматогониальных метафаз до ме-тафаз второго мейотического деления. Продолжительность преобразований от сперматогоний до сперматозоидов занимает около 8—9 нед. Длительность отдельных стадий весьма различна, поэтому клетки разных стадий встречаются с неодинаковой частотой. Наиболее важные для цитогене-тического анализа стадии пахитены и диакинеза обычно представлены достаточным числом клеток.3
В женском организме мейоз протекает в два этапа, разделенных большим промежутком времени. Первый этап, включающий формирование оогоний и прохождение первого мейотического деления, проходит в эмбриональных яичниках. К моменту рождения девочки в яичниках все оогоний дифференцированы в ооциты, а последние прошли стадии лептотены — пахитены и остановились в стадии диплотены. Пребывание в этой стадии, получившей название диктиотены, продолжается весь постнатальный период жизни женщины. Последующее развитие клетки из стадии диктиотены в зрелую яйцеклетку происходит циклически, по одной клетке ежемесячно, и заканчивается овуляцией. Изложенное объясняет, почему ранние стадии первого мейотического деления у женщины можно анализировать лишь в раннем эмбриональном периоде, а последующие стадии в обычных условиях изучению недоступны.
Основные сведения по организации мейотических хромосом человека получены при изучении клеток семенников. Можно выделить следующие аспекты этих исследований.
Анализ линейной структуры индивидуальных хромосом. Характерной особенностью структуры мейотических хромосом, выраженной преимущественно на первых стадиях профазы мейоза, является их хромомерное строение (рис. 12). Из данных по цитологии мейотических хромосом некоторых видов растений хорошо известна индивидуальность хромомерного строения каждой хромосомы («Цитология и генетика мейоза» В. В. Хвостовой и Ю. В. Богданова, 1975). К сожалению, индивидуальные биваленты в хромосомном наборе человека, как мужском, так и женском, можно выделить лишь в поздней пахитене, когда они значительно сокращены и хромомерность их строения существенно утрачена. Тем не менее в результате нескольких попыток пахитенного анализа хромосом получены первые сведения о морфологии бивалентов акроцентрических и некоторых других хромосом (под ред. А. А. Прокофьевой-Бельговской, 1969; Hungeriord, 1973).
В идентификации пахитенных бивалентов с определенным успехом применены С- и Q-методы дифференциальной окраски (Goetz, 1975). Обнаружено полное совпадение между рисунками G-окрашивания и хромомерным строением пахитенных хромосом, а также между рисунками окрашенных по G-методу мейотических и митотических хромосом (Luciani e. a., 1975).
Хромосомная конъюгация и образование хиазм. Исследование диакинеза — метафазы I мейоза в клетках мужчин показало, что гомологичная конъюгация является обязательной для всех хромосом человека, включая короткие. В том или ином биваленте имеется от 1 до 6 хиазм; по данным разных авторов, их общее число на хромосомный набор колеблется от 35 до 66 (Ford, 1973). Распределение хиазм в индивидуальных бивалентах стало возможным анализировать после того, как каждый бивалент удалось идентифицировать на основе последовательной окраски по Q- и С-технике (Hulten, 1974). По данным Hulten (1974), средняя частота хиазм в индивидуальных аутосомах пропорциональна длине хромосомы. На нее не влияют численные или структурные нарушения в других хромосомах. По-видимому, хиазмы формируются в определенных районах каждой хромосомы. Выяснение числа и локализации хиазм в каждой хромосоме имеет важное значение при их генетическом картировании.
Идентификация хромосомных аномалий. Явление конъюгации гомологичных хромосом в мейозе используется для индентификации многих хромосомных перестроек, затрагивающих линейную структуру хромосомы. Делеции, вставки, инверсии, реципрокные транслокации, дуплика-ции приводят к изменению конфигурации бивалента. Возникают униваленты, триваленты и т. д. В сочетании с анализом митотических хромосом исследование морфологии мейотических хромосом в пахитене, диакинезе и мета-фазе I неоднократно проводилось в случаях численных или структурных изменений аутосом, половых хромосом у мужчин с бесплодием (А. А. Прокофьева-Бельговская и В. К. Борджадзе, 1971; Kjessler, 1966; Hulten, 1974, и др.). Субмикроскопическая или надмолекулярная организация хромосомного аппарата изучена совершенно недостаточно. Если о строении хромосомы на уровне световой микроскопии и о молекулярном строении наследственного материала в настоящее время накоплена обширная информация, то промежуточные ступени ультраструктурной организации хромосомы остаются в основном неизвестными. Нет пока никаких фактических предпосылок ставить вопрос о возможной специфике ультраструктурной организации генетического аппарата человека.
Наиболее ценную информацию о тонкой структуре функционирующих хромосом принесло исследование политенных хромосом, которые являются специфической, но естественной моделью хромосом интерфазного ядра в клетках двукрылых, и хромосом типа «ламповых щеток», обнаруживающихся в ооцитах амфибий в мейотической профазе I. Большие размеры этих хромосом позволили провести тщательное их изучение под световым микроскопом. В результате этих исследований сформулированы положения, которые рассматриваются как принципиальные для организации хромосом эукариотов в целом (И. И. Кикнадзе, 1972).
В интерфазном ядре хромосомные районы, соответствующие эухроматину, имеют хромомерное строение. Каждая хромомера является структурной и функциональной единицей хромосомы как продольно дифференцированной органеллы. Дифференциальная транскрипция этих единиц структурно обеспечивается деконденсацией упакованного в ней дезоксирибонуклеопротеида, что выражается в форме пуфов в политенных хромосомах, или петель в хромосомах типа «ламповых щеток».
Методом исследования тонкой структуры интерфазных ядер, не обладающих политенными хромосомами, а также метафазных хромосом является электронная микроскопия (Ю. С. Ченцов, В. Ю. Поляков, 1974). К сожалению, на основании результатов, полученных этим методом, пока не удалось составить цельного представления об ультраструктуре интерфазного ядра. На электронограммах ультратонких срезов основная обнаруживаемая морфологическая единица — это нить в разных сечениях диаметром 10 нм и меньше. На препаратах хроматина, распластываемого на поверхности водного мениска, обнаруживаются протяженные нити около 23—25 нм в диаметре.
Несмотря на многочисленные исследования митотических или мейотических хромосом, данные по их ультраструктуре, которые позволили бы создать непротиворечивую модель упаковки элементарной хромосомной нити во время клеточного деления, остаются скудными. Наибольшая информация получена по ультраструктуре специализированных районов хромосом: центромерного района, ядрышка, синаптонемального комплекса в мейотическпх хромосомах. Данные электронной микроскопии целых изолированных хромосом использованы для их идентификации, при этом специальное внимание уделено метафазным хромосомам человека (Bahr, Larsen, 1974). Этот метод позволил обнаружить неравномерную плотность упаковки элементарных хромосомных нитей по длине хромосом, и рисунок этой неравномерности оказался совпадающим с линейной дифференцированностыо структуры хромосомы, выявляемой под световым микроскопом. Элементарные фибриллы на электронограммах целых распластанных хромосом имеют размер порядка 25—30 нм. Биохимическое исследование таких фибрилл и соответствующие расчеты дают основание заключить, что молекулы нуклеопротеидов находятся в них в сверхскрученном состоянии и что, кроме гистонов, фибриллы содержат другие белки.
Достаточно полное освещение вопросов молекулярной генетики и хромосомной организации в многочисленных специальных монографиях и руководствах (С. Е. Бреслер, 1973; И. П. Ашмарин, 1974; Г. Стент, 1974, и др.) исключают необходимость подробного рассмотрения этих вопросов в данной книге. Сравнительно новый молекулярный аспект хромосомной организации возник в связи с разработкой методов фракционирования тотальной ДНК генома по повторяемости сходных нуклеотидных последовательностей и методов гибридизации нуклеиновых кислот на хромосомных препаратах. Эти методы открыли возможность выяснения локализации разных фракций ДНК в хромосомном наборе. Важными находками, полученными в этой новой области, пограничной между молекулярной и цитологической генетикой, были: а) обнаружение в геноме эукариотов, помимо ДНК с уникальными последовательностями, большой доли ДНК с одинаковыми или близкими последовательностями нуклеотидов, повторяющимися многие сотни и тысячи раз (Г. П. Георгиев, 1973; С. А. Лимборская, 1975); б) обнаружение неравномерной локализации ДНК с разными характеристиками в хромосомном наборе: ДНК с наибольшим числом повторяющихся последовательностей локализуется в гетерохроматиновых районах хромосом.
К настоящему времени фракционирование ДНК и определение хромосомной локализации фракций проведено на многих видах организмов. Каждый вид характеризуется своей специфической структурой генома в отношении состава ДНК и спецификой их распределения по хромосомам набора. Многие работы этого направления выполнены на клетках человека. Полученные в них результаты подытожены А. Ф. Захаровым (1977) и Jones (1973).
ДНК генома человека может быть фракционирована на ДНК с уникальными копиями (около 64%) и ДНК с повторяющимися последовательностями. По скорости ренатурации, которая отражает повторяемость нуклеотидных последовательностей, последняя фракция может быть подразделена на ДНК с малой (13,4%), промежуточной (12,3%) и высокой (10,3%) скоростью ренатурации молекул ДНК. Таким образом, в геноме человека около 10% всей ДНК имеет высокую многократность повторения одинаковых последовательностей.
Методом градиентного ультрацентрифугирования в группе ДНК с высокой повторяемостью последовательностей выделены по крайней мере четыре типа так называемых сателлитных ДНК. Помимо этих видов ДНК, в экспериментах с гибридизацией ДНК — РНК исследована хромосомная локализация ДНК, кодирующая синтез 5S, 18S и 28S рибосомных РНК. В настоящее время распределение разных типов ДНК в хромосомах человека вырисовывается следующим образом.
ДНК с низкой и промежуточной повторяемостью нуклеотидных копий обнаруживается во всех хромосомах, причем она локализуется по всей длине их плеч.
ДНК с высокой повторяемостью нуклеотидных копий обнаруживается преимущественно в околоцентромерных и отчасти теломерных районах. Сателлитные индивидуальные ДНК распределены в разных хромосомах неравномерно. Так, сателлитной ДНК I и IV особенно богата Y-xpoмосома, в хромосомах 1 и 16 больше всего содержится сателлитной ДНК II, а в хромосоме 9 — III. Рибосомная ДНК 18S и 28S заключена почти исключительно в коротких плечах всех 10 акроцентрических хромосом. Дистальная часть длинного плеча аутосомы 1 — преимущественное место для пистронов, кодирующих 5S РНК. Не исключена возможность, что методом гибридизации ДНК с РНК in situ удастся картировать не только полигенные ло-кусы, но также структурные гены, повторяющиеся малое число раз (Rotterdam. Conference, 1974).
Две важнейшие черты генетической организации эукариотов - дифференциальная активность структурных генов и большая доля генов, регулирующих этот процесс,— должны иметь основой соответствующую структурную организацию хромосомы. Десятилетия упорного труда цитогенетиков значительно приблизили нас сегодня к пониманию того, как в хромосоме взаимодействуют структура и функция, как хромосома осуществляет свою сложную роль интеграции системы генов.
Первая фундаментальная черта структурно-функциональной организации хромосомы состоит в существовании двух разных функциональных типов хромосомного материала — эухроматина и гетерохроматина. Их основное различие заключается в транскрипционной активности.
Отсутствие генетической активности у гетерохроматина обусловлено либо его бедностью структурными генами (структурный гетерохроматин), либо временным выключением участка хромосомы, несущего такие гены, из генетической транскрипции (факультативный гетерохроматин, гетерохроматинизация).
Второй важнейшей чертой хромосомной организации является линейная расчлененность хромосомы па участки, состоящие из хроматина разного типа. Каждая хромосома отличается своим уникальным порядком расположения гетеро- и эухроматиновых районов.
Подразделенность хроматина по генетическому значению хорошо коррелирует с различием типов хроматина и по ряду других характеристик: состоянию конденсации в интерфазном ядре и хронологии конденсации в митотическом и мейотическом цикле; времени репликации ДНК;
отношению к окраске флуорохромами или нефлуоресцирующими красителями; чувствительности к повреждающему действию химических мутагенов; химическим особенностям ДНК и, по-видимому, белков, входящих в состав хроматина; фенотипическим проявлениям хромосомных перестроек. Для гетерохроматина характерны конденсированное состояние в интерфазном ядре, опережающая конденсация в профазе митоза и мейоза, возможность отставать в конденсации спонтанно или под влиянием некоторых воздействий в метафазе митоза. По сравнению с эухроматином гетерохроматиновые районы хромосом репродуцируются в более поздние отрезки S-периода. При дифференциальной окраске по G- и С-методике гетерохроматиновые сегменты сохраняют способность к окрашиванию (G-сегменты) и даже усиленно красятся (С-сегменты). В цитогенетике хорошо известна неравномерность распределения по длине хромосомы ее структурных повреждений, индуцируемых мутагенными веществами: повышенной повреждаемостью отличаются именно гетерохроматиновые районы. ДНК с неоднократно повторяющимися нуклеотидными последовательностями характерна именно для гетерохроматина. В отличие от эухроматина, содержащего уникальные гены, дисбаланс по которым отрицательно отражается на фенотипе организма, изменения в количестве гетерохроматина не влияют или значительно меньше влияют на развитие признаков организма.
Взаимосвязанность различных структурных и функциональных характеристик хромосомы — третья фундаментальная черта хромосомной организации. Вопрос о причинно-следственных связях в отмеченном корреляционном комплексе активно исследуется. Ответ должен быть получен, в частности, на вопрос о том, сводимо ли все разнообразие свойств разных видов хроматина к различиям в химических особенностях хромосомной ДНК. Однако независимо от прогресса в понимании этих корреляций их феноменология служит главным инструментом к познанию структурно-функциональной расчлененности каждой конкретной хромосомы человека. В продольной дифференцированности индвидуальных хромосом по плотности конденсации, по окрашиваемости теми или иными красителями, по особенностям составляющей их ДНК и другим характеристикам заложены не формальные признаки идентификации хромосом или их участков, а признаки, имеющие генетический смысл. Эта новая область цитогенетики человека активно развивается, и в сочетании с успехами в картировании хромосом поднимет цитогенетику человека на еще более высокий уровень. Из уже имеющихся по этой проблеме сведений интерес для генетики представляют следующие.
Гетерохроматин, окрашивающийся по методике С-окраски, обнаруживается во всех хромосомах человека и называется структурным гетерохроматином. Во всех аутосомах и Х-хромосоме он занимает, как в большинстве хромосом других биологических видов, околоцентромерный район. В Y-хромосоме он локализуется в дистальной части длинного плеча. В разных хромосомах количество С-гетерохроматина разное. Особенно крупные его блоки, распространяющиеся преимущественно на длинные плечи, содержатся в аутосомах 1, 9 и 16; именно эти районы известны в качестве наиболее регулярных вторичных перетяжек. Особенно мелкие блоки этого хроматина наблюдаются в аутосоме 2 и в Х-хромосоме. В акроцентрических хромосомах гетерохроматин распространяется на короткие плечи.
По-видимому, в разных хромосомах околоцентромерный гетерохроматин неодинаков, что следует из ряда фактов. Эта разнородность обнаруживается уже по разному оптимуму времени и рН щелочного диапазона, применяющегося в технике С-окраски, при которых С-хроматин появляется в разных хромосомах. Неоднородность особенно демонстративна при окрашивании хромосом акрихином или акрихин-ипритом: С-гетерохроматин аутосом 1, 9 и 16 совершенно не флуоресцирует, а гетерохроматин аутосом 3, 4, акроцентрических хромосом и Y-хромосомы светится чрезвычайно ярко. Генетическое значение разнородности С-гетерохроматина человека пока не ясно. Химическая основа этой разнородности начинает проясняться. Экспериментами с гибридизацией ДНК с РНК на цитологических препаратах установлено, что различия гетерохроматина разных хромосом человека могут быть связаны с особенностями структуры ДНК. Во всех случаях это ДНК с повторяющимися нуклеотидными последовательностями, однако в разных хромосомах содержатся, по-видимому, разные классы ДНК. Так, из хорошо охарактеризованных сателлитных ДНК сателлиты I и IV в большом количестве содержатся в Y-хромосоме, сателлит II — в гетерохроматине аутосомы 1 и 16, сателлит III — в гетерохроматине аутосомы 9. Структурный гетерохроматин акроцентрических хромосом — основной носитель рибосомной ДНК.
В полном соответствии с данными общей цитогенетики о слабом отрицательном влиянии дисбаланса по гетерохроматиновому материалу на развитие организма находятся сведения о существовании в человеческой популяции значительного полиморфизма, обусловленного размерами околоцентромерного гетерохроматина. Особенно сильно варьирует содержание структурного гетерохроматина С-типа в аутосомах 1, 4, 9, 13—15, 16, 21—22 и Y-хромосоме. Отсутствие фенотипических отклонений от нормы у большинства носителей таких кариотипических вариантов позволяет рассматривать их как варианты нормы. Однако эта проблема поставлена на повестку дня совсем недавно. Она требует тщательных исследований на большом популяционном материале, прежде чем будут намечены обоснованные границы хромосомной нормы, за пределами которой для организма становится не безразличным дисбаланс и по гетерохроматину.
Есть много оснований рассматривать хромосомные районы, положительно окрашивающиеся по G-методике, как разновидность структурного гетерохроматина. В пользу этого представления, помимо отношения к красителям, свидетельствуют поздняя репликация этих районов, образование ими хромомер в профазных мейотических хромосомах, способность отставать в митотической конденсации под влиянием 5-бромдезоксиуридина или холода. Важно отметить, что дисбаланс по аутосомам, особенно богатым G-окрашивающимся хроматином, влечет за собой возникновение наименее тяжелых аномалий развития для индивида — носителя такого дисбаланса. Так, именно к этой категории хромосомных аномалий относятся трисомии 13, 18 и 21. Имеются сообщения и о том, что ДНК со средней повторяемостью одинаковых нуклеотидных последовательностей локализуется в G-окрашивающихся сегментах хромосом.
Вопросы, которые стоят перед цитогенетикой человека в отношении структуры, локализации и особенно генетического значения структурного гетерохроматина, сравнительно новые.
Прогресс в их разрешении нельзя отделить от прогресса в расшифровке природы гетерохроматина у эукариотов в целом.
Помимо структурного гетерохроматина, существует ф а-культативный гетерохроматин, появление которого в хромосоме обусловлено гетерохроматинизацией эухроматических районов при особых условиях. Имеются достоверные доказательства существования этого явления в хромосомах человека на примере генетической инактивации одной из Х-хромосом в соматических клетках женщины. У человека и других млекопитающих это частный случай явления, впервые открытого на дрозофиле Muller в 1932 г. и получившего название «компенсации д